一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，包括下述步骤：(1)利用MS培养基培养诱导小麦胚性愈伤组织；(2)采用液体MS培养基培养制备小麦悬浮单细胞群；(3)利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体；(4)采用

【技术实现步骤摘要】
一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法


[0001]本专利技术涉及一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，属于核科学技术的应用、辐照育种


技术介绍

[0002]农作物优良品种的应用对我国粮食增产贡献率超过45％，而突破性作物新品种的育成取决于优异种质资源的创制与利用。主要农作物如小麦等选育技术有杂交育种、辐射诱变育种、分子育种，其中辐射诱变技术在培育作物新品种上已发挥重要作用，但相较于基因编辑等精准突变，存在诱变效率低、有利变异频率低、变异方向和性质不可控等问题，因此，通过组织培养诱导小麦等外植体愈伤组织，悬浮培养胚性愈伤组织，获得单细胞群。针对单细胞群遗传背景一致，对诱变敏感、突变位点丰富，但对突变致死忍耐性差的特点，将小麦等单细胞固定化进行γ
‑
射线或高能电子束辐照，有效提高单细胞存活率和诱变效率；突变的单细胞可大规模培养，为细胞水平上筛选和创制小麦新种质提供了库容丰富、高效复制的样品库，可实现“空间小、群体大、效率高、过程短”的高效单细胞定向诱变和重要非生物胁迫抗性筛选。将经过抗性筛选存活的诱变单细胞通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质。创新性的开发出基于小麦单细胞的“γ
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射线或高能电子束辐照+定向筛选”诱变新技术，为实现小麦种业可持续发展提供了新的技术思路和技术途径。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0004]本专利技术的目的在于提供一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法。通过组织培养诱导小麦胚性愈伤组织；悬浮培养小麦胚性愈伤组织获得单细胞群；将小麦单细胞群固定获得固定化载体；对小麦单细胞群固定化载体进行γ
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射线或高能电子束辐照，有效提高单细胞存活率和诱变效率；对辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体进行抗性筛选；筛选出具有高温、低温、干旱、盐胁迫等耐性的小麦突变单细胞；通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质。
[0005]本专利技术的技术方案为：
[0006]一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，依次包括以下步骤：
[0007]A、利用MS培养基培养诱导小麦胚性愈伤组织；
[0008]B、采用液体MS培养基培养制备小麦悬浮单细胞群；
[0009]C、利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体；
[0010]D、采用
60
钴γ
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射线或高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变；
[0011]E、对辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体进行抗性筛选；
[0012]F、将小麦单细胞固定化载体上经过抗性筛选存活的诱变单细胞通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质。
[0013]优选的是：所述诱导小麦胚性愈伤组织所用的MS培养基为添加有3mg/L 2,4
‑
D、0.1mg/L KT、40g/L蔗糖、10g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。
[0014]优选的是：所述培养制备小麦悬浮单细胞群所用的液体MS培养基为添加有4.5mg/L 2,4
‑
D、0.2mg/L KT、50g/L蔗糖的液体MS培养基，pH为5.8。
[0015]优选的是：所述固体MS培养基为添加有3mg/L 2,4
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D、0.1mg/L KT、50g/L蔗糖、15g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。
[0016]优选的是：所述培养诱导小麦胚性愈伤组织和培养制备小麦悬浮单细胞群包括以下过程：
[0017]将发芽小麦种子分别用70％酒精、0.1mol/L次氯酸钠消毒、去壳、切胚，将切下的胚置于培养诱导小麦胚性愈伤组织的MS培养基上，25℃培养，得到直径达3mm的小麦愈伤组织；
[0018]取上述直径达3mm的小麦愈伤组织接种于培养制备小麦悬浮单细胞群的液体MS培养基中，接种后的液体MS培养基进行超声振荡处理20min，然后振荡速度为100rpm，25℃进行震荡培养，得到小麦悬浮单细胞群。
[0019]优选的是：利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体包括以下过程：
[0020]将固体MS培养基各组分充分混合，加热至琼脂完全溶解，在无菌条件下冷却至50℃，加入已过滤除去液体培育基的小麦悬浮单细胞群搅拌均匀包埋；包埋后趁热倒入培养皿中，液面高度0.5cm，待冷却凝固，用打孔器制成直径0.5cm的小麦单细胞固定化载体。
[0021]优选的是：所述采用60钴γ
‑
射线对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变是采用
60
钴γ
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射线对小麦单细胞固定化载体进行辐照剂量为20Gy～300Gy、剂量率为10Gy/min的辐照诱变；
[0022]所述采用高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变是采用10MeV/20kW高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照剂量为20Gy～300Gy、剂量率为10Gy/min的辐照诱变。
[0023]优选的是：所述抗性筛选是将辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体置于40℃高温、0℃低温、相对湿度10％干旱、50mM NaCl盐胁迫的一种或两种以上组合环境中处置72小时。
[0024]优选的是：将小麦单细胞固定化载体上经过抗性筛选存活的诱变单细胞通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质包括以下过程：
[0025]在无菌条件下，将经过抗性筛选存活的小麦诱变单细胞接种于单细胞胚性愈伤组织诱导培养基上，于25℃温度环境下暗培养，直至诱导获得的小麦胚性愈伤组织直径达3毫米；
[0026]将直径达3毫米的小麦胚性愈伤组织转接入单细胞胚性愈伤组织分化培养基上，于25℃温度和12小时7500 1x光照环境下进行分化培养，直至形成株高10厘米、根叶芽俱全的再生株系；
[0027]打开具有完整再生株系的培养瓶，加入适量自来水，置于室温下炼苗、驯化3天，洗去根部残留的培养基，将再生株系移栽入大田，经筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的
KT、50g/L蔗糖、15g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8；
[0043](2)将用于小麦单细胞群包埋的固体MS培养基各组分充分混合，加热至琼脂完全溶解，在无菌条件下冷却至50℃，加入已过滤除去液体培育基的小麦悬浮单细胞群搅拌均匀包埋；
[0044](3)包埋后趁热倒入培养皿中，液面高度0.5cm，待冷却凝固，用打孔器制成直径0.5cm的小麦单细胞固定化载体。
[0045]4、采用
60
钴γ
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射线对小麦单细胞固定化载体进行辐照剂量为20Gy、剂量率为10Gy/min的辐照诱变；
[0046]5、对辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体进行抗性筛选，将辐照诱变后的小麦单细胞固定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：依次包括以下步骤：A、利用MS培养基培养诱导小麦胚性愈伤组织；B、采用液体MS培养基培养制备小麦悬浮单细胞群；C、利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体；D、采用
60
钴γ
‑
射线或高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变；E、对辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体进行抗性筛选；F、将小麦单细胞固定化载体上经过抗性筛选存活的诱变单细胞通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质。2.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述诱导小麦胚性愈伤组织所用的MS培养基为添加有3mg/L2,4
‑
D、0.1mg/L KT、40g/L蔗糖、10g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。3.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述培养制备小麦悬浮单细胞群所用的液体MS培养基为添加有4.5mg/L 2,4
‑
D、0.2mg/L KT、50g/L蔗糖的液体MS培养基，pH为5.8。4.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述固体MS培养基为添加有3mg/L 2,4
‑
D、0.1mg/L KT、50g/L蔗糖、15g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。5.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述培养诱导小麦胚性愈伤组织和培养制备小麦悬浮单细胞群包括以下过程：将发芽小麦种子分别用70％酒精、0.1mol/L次氯酸钠消毒、去壳、切胚，将切下的胚置于培养诱导小麦胚性愈伤组织的MS培养基上，25℃培养，得到直径达3mm的小麦愈伤组织；取上述直径达3mm的小麦愈伤组织接种于培养制备小麦悬浮单细胞群的液体MS培养基中，接种后的液体MS培养基进行超声振荡处理20min，然后振荡速度为100rpm，25℃进行震荡培养，得到小麦悬浮单细胞群。6.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体包括以下过程：将固体MS培养基各组分充分混合，加热至琼脂完全溶解，在无菌条件下冷却至50℃，加入已过滤除去液体培育基的小麦悬浮单细胞群搅拌均匀包埋；包埋后趁热倒入培养皿中，液面...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，邢国风，胡尚连，罗学刚，曹颖，刘继恺，
申请(专利权)人：西南科技大学，
类型：发明
国别省市：