一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法技术

本发明专利技术公布了一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法


[0001]本专利技术属于生物技术研发
，尤其是涉及一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法。

技术介绍

[0002]柑橘类果树不仅品种间容易杂交，而且种间以及柑橘属与其近缘属之间都能杂交，其杂交第一代即有较大的分离。因此，杂交育种在柑橘育种中占有最重要的地位。在90多年的世界柑橘杂交育种史上，已培育出了众多的新品种。传统杂交柑橘的育种周期长，其主要原因就是柑橘童期漫长。柑橘童期是指柑橘从种子播种到开花所经历的时间年数。通常情况下，杂交后代柑橘种子播种后，要到第7年或第8年才开始开花，即柑橘的童期要7、8年，加上后续性状观察与遗传稳定性鉴定，育成一个杂交柑橘品种平均要耗时18年多。这一特性严重阻碍柑橘育种工作效率，也致使柑橘成为杂交育种周期最长的果树之一。因此，避开柑橘童期的研究成为提高柑橘育种工作效率的关键所在。
[0003]芽变选种也是培育柑橘新品种的重要方法之一，简单、见效快，易被人们掌握。
[0004]芽变是柑橘体细胞突变的一种，突变发生在芽的分生组织中，当芽萌发长成枝条，性状表现与原品种有质的差异，即为芽变。变异芽萌发成枝称枝变，把枝变的芽培养成一个一个新品种的方法称为芽变选种。
[0005]柑橘是产生自然突变（芽变）频率较高的果树，每500个侧枝中就有一个枝变，但优良变异的频率低得多。芽变选种是在生产园中选取三年生以上丰产稳产的结果柑橘树，经三年的观察、鉴定，并将结果记录归档。初选优良单株经过高接鉴定，观察其性状的稳定性，再进入选种圃，做全面综合性鉴定，同时开展区域性鉴定。可见，自然芽变选种劳动力成本和经济成本均很高。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法。该方法大大缩短了育种进程。
[0007]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用的技术方案是：一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，包括以下步骤：
①
配置液体培养基: 在MS液体培养基中加入抗生素母液，抗生素母液的工作浓度为50 μg/ml；
‑
20℃保存备用；
②
带菌枝条消毒：选取外观无明显病斑，长势较好的需要脱除病菌柑橘成年树枝条，制成外植体，消毒15
‑
25分钟，无菌水冲洗4
‑
5次，获得灭菌枝条；
③
在灭菌试管中装入2ml 步骤
①
配制的液体培养基，将步骤
②
获得的灭菌枝条放置于灭菌试管中，在光照强度为1600
‑
2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下培养，10
‑
15天后陆续长出新芽；
④
配制诱变液体培养基：将MT液体培养基与EMS液体培养基混合，配制成诱变液体
培养基；
⑤
茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，对长出新芽的枝条进行剥取，获得长度为0.4
‑
0.6mm的茎尖生长点；将茎尖生长点接种于2
‑
3ml诱变液体培养基中，室温放置，获得诱变茎生长点；采用本申请的液体诱变培养基有利于增加茎尖生长点的存活率。本申请采用0.4
‑
0.6mm的茎尖生长点，是因为如果茎尖生长点超过0.6mm，不利于进行微芽嫁接的操作，因为黄化苗直径有限。但是如果茎尖生长点小于0.4mm，茎尖存活率会显著下降。
[0008]⑥
选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，消毒，用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；
⑦
将消毒砧木种子接种到MS固体培养基中，25℃暗培养13～15天，获得高度为6～9cm的黄化小苗；
⑧
选取茎直径 ≥2mm的黄化小苗，切去茎上部，在离茎上端 3～5mm处切出T形切口；将诱变茎尖生长点置于T形切口的中间，获得嫁接苗；
⑨
将嫁接苗置于培养箱中，在光照强度为1600
‑
2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下进行嫁接培养，至待接穗芽长至0.5～1cm 时，再二次嫁接于温室。
[0009]优选地，所述抗生素母液是抽滤处理过的。抗生素母液经过抽滤处理进行灭菌，有效防止抗生素在高温下失活。
[0010]优选地，所述抗生素为硫酸链霉素。
[0011]进一步地，所述灭菌试管在使用前用封口膜封好，灭菌后备用。
[0012]优选地，所述EMS液体培养基的体积百分浓度为0.1/%。
[0013]进一步地，所述MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：（0.08—0.12）。
[0014]优选地，所述MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：0.1。
[0015]当MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：（0.08—0.12）时，可以获得很好的茎尖诱变率和存活率，尤其是MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：0.1时，茎尖诱变率和存活率能够达到最佳效果，如果EMS液体培养基的用量减少，诱变率会严重下降，如果EMS液体培养基的用量高于0.12%，存活率则严重下降。试验证明， MT液体培养基与每100ml含蔗糖7—8g的诱变MT培养基共同作用，茎尖存活率最高，存活率是单独使用EMS培养基的8—10倍。
[0016]进一步地，所述MT液体培养基中蔗糖的质量浓度为7～8%。诱变液体培养基中含有蔗糖质量浓度为7—8%的MT液体培养基可以大幅度增加存活率，如果诱变培养基中只含有EMS液体培养基，茎尖存活率会大幅度下降。
[0017]优选地，所述步骤
⑤
将茎尖生长点接种于诱变液体培养基中，用封口膜封好，室温放置3
‑
5个小时。
[0018]进一步地，所述外植体的制备方法，包括以下步骤：选取外观无明显病斑，长势较好的需要脱除病菌柑橘成年树枝条，剪去叶片，清洗表面尘土，切成6～7cm长的茎段。
[0019]进一步地，步骤
②
和
⑥
中所述消毒，包括以下步骤：先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒15～25min。
[0020]本专利技术所具有的优点和有益效果是：本专利技术一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，以MT液体培养基与EMS液体培
养基为原料，配制成诱变液体培养基进行诱变，具有较高的突变频率和较少的染色体畸变，使ＤＮＡ分子上产生较多的点突变，对处理材料损伤轻，不容易引起生活力和可育性下降。本专利技术选用春见柑橘的EMS化学诱变离体芽作嫁接芽，选用枳壳或枳橙种子作为砧木进行诱变离体芽的嫁接，诱变过程使用离体茎尖在诱变培养液中进行，相比传统方法只能使用果树进行杂交育种和自然芽变筛选，大大节省了选育成本和空间，因为使用成年态茎尖进行化学诱变，避开了果树童期，大大缩短育种进程，具有很大的市场潜力，能创造出更好的经济价值。本专利技术成本低廉，操作简便。
具体实施方式
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①
配置液体培养基: 在MS液体培养基中加入抗生素母液，抗生素母液的工作浓度为50μg/ml；
‑
20℃保存备用；
②
带菌枝条消毒：选取需要脱除病菌的柑橘成年树枝条，制成外植体，消毒15
‑
25分钟，无菌水冲洗4
‑
5次，获得灭菌枝条；
③
在灭菌试管中装入2ml 步骤
①
配制的液体培养基，将步骤
②
获得的灭菌枝条放置于灭菌试管中，在光照强度为1600
‑
2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下培养，10
‑
15天后陆续长出新芽；
④
配制诱变液体培养基：将MT液体培养基与EMS液体培养基混合，配制成诱变液体培养基；
⑤
茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，对长出新芽的枝条进行剥取，获得长度为0.4
‑
0.6mm的茎尖生长点；将茎尖生长点接种于2
‑
3ml诱变液体培养基中，室温放置，获得诱变茎尖生长点；
⑥
选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，消毒，用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；
⑦
将消毒砧木种子接种到MS固体培养基中，25℃暗培养13～15天，获得高度为6～9cm的黄化小苗；
⑧
选取茎直径≥2mm的黄化小苗，切去茎上部，在离茎上端 3～5mm处切出T形切口；将诱变茎尖生长点置于T形切口的中间，获得嫁接苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜晓秋，黎德富，刘莉莎，何发，何晋宇，张晓，
申请(专利权)人：南充市农业科学院，
类型：发明
国别省市：