一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法。具体地，所述方法包括如下步骤：在氨基转移酶突变体的存在下，将化合物I和氨基供体在反应溶剂中进行胺化反应，得到化合物II即可；所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有一个或多个位点的氨基酸残基的差异。本发明专利技术基于上述氨基转移酶突变体，开发了合成β

【技术实现步骤摘要】
一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法。

技术介绍

[0002]手性内酰胺类化合物是一种重要的药物合成前体，是多种处于临床阶段的创新化学药的重要砌块。
[0003]此前的合成方法需要至少6步化学反应，包括3步贵金属(钌，铑、钯等)催化，步骤多、收率低、成本高、原子经济性差、对环境不友好，不是一条绿色可持续的合成路线；通过酶催化的方法来合成手性内酰胺，可缩短路线至3步，且原子经济性高，反应主要在水溶液中进行，安全环保，符合绿色化学原则。
[0004]然而迄今为止，大部分的氨基转移酶催化得到的是β
‑
(R)手性胺，能够得到β
‑
(S)手性胺的情况主要有以下三种：一是α位有取代；二是β位取代基比较大；三是α位有取代，且β位取代基比较大。
[0005]通过天然或进化酶，催化α位没有取代且β位取代基最小(为H)的底物反应，制得β
‑
(S)手性内酰胺，且具有β
‑
(S)手性内酰胺高e.e.值，是一项极具挑战性的工作。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中的天然或进化酶难以制得β
‑
(S)手性内酰胺。为此，本专利技术提供了一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法。本专利技术通过酶进化的技术手段，得到可以催化合成β
‑
(S)手性内酰胺的氨基转移酶，本专利技术从目前已知的一种来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的天然氨基转移酶出发，该野生型的氨基转基酶催化得到的是β
‑
(R)手性内酰胺(e.e.～10％)，经过定向进化得到若干立体选择性更高β
‑
(S)手性内酰胺(e.e.≥80％)、催化活性更好、热耐受性更好的突变体，具有较高的工业应用价值。
[0007]本专利技术提供了一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法，其包括如下步骤：在氨基转移酶突变体的存在下，将化合物I和氨基供体在反应溶剂中进行胺化反应，得到化合物II即可；
[0008][0009]其中，R1为
‑
CHO；
[0010]R2为
‑
Me；
[0011]所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0012]所述的突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0013]第3位、第4位、第5位、第7位、第15位、第19位、第25位、第29位、第32位、第48位、第51位、第56位、第58位、第59位、第60位、第61位、第69位、第77位、第84位、第86位、第108位、第110位、第119位、第120位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第126位、第144位、第147位、第148位、第150位、第151位、第152位、第155位、第159位、第161位、第164位、第174位、第175位、第199位、第201位、第202位、第209位、第210位、第235位、第236位、第238位、第239位、第240位、第241位、第242位、第243位、第244位、第249位、第257位、第260位、第261位、第270位、第272位、第273位、第274位、第295位、第296位、第297位、第307位、第308位、第314位、第322位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位、第332位、第350位、第358位、第373位、第374位、第376位、第387位、第396位、第398位、第403位、第410位、第424位、第428位、第435位、第436位、第437位、第442位、第451位、第472位和第474位中的一个或多个。
[0014]在某一方案中，所述的氨基供体为本领域常规的氨基供体，较佳地，所述氨基供体为异丙胺、L
‑
丙氨酸、DL
‑
丙氨酸、L
‑
赖氨酸、DL
‑
赖氨酸、(S)
‑1‑
苯乙胺、(R)
‑1‑
苯乙胺、(RS)
‑1‑
苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺、2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种；较佳地，所述氨基供体为异丙胺。
[0015]在某一方案中，所述的氨基供体与所述的化合物I的摩尔比为本领域常规的摩尔比；优选为(1～5):1，例如1:1、2:1或4:1。
[0016]在某一方案中，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液，或缓冲液和本领域常规的有机溶剂数的混合物，所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、1,4
‑
二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇。
[0017]在某一方案中，当所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液和本领域常规的有机溶剂的混合物时，所述的有机溶剂占反应总体积的比例为0～250mL/L。
[0018]在某一方案中，所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液。
[0019]在某一方案中，所述的缓冲液为本领域常规的缓冲液，优选为硼酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(TRIS)和三乙醇胺盐缓冲液(TEOA)中的一种或多种；更优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液。
[0020]在某一方案中，所述的缓冲液与所述的化合物I的体积质量比为本领域常规的体积质量比；优选为10～50mL/g，例如10mL/g、20mL/g或50mL/g。
[0021]在某一方案中，所述的氨基转移酶突变体与所述的化合物I的质量比为本领域常规的体积质量比；优选为1:(1
‑
2)，例如1:2。
[0022]在某一方案中，所述的胺化反应的pH值为本领域常规的pH值，优选为6.0～10.5；更优选为7.0～9.0；例如7.0、8.0或9.0。
[0023]在某一方案中，所述的胺化反应的反应温度为本领域常规的反应温度，优选为27℃～55℃(例如27℃、37℃或47℃)；更优选为47℃。
[0024]在某一方案中，所述的胺化反应的反应时间为本领域常规的反应时间，反应时间同通常与反应规模相关，优选为16～20h；例如16h。
[0025]在某一方案中，所述的手性内酰胺类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述的缓冲液和所述的氨基供体的混合液中，加入化合物I和所述的氨基转移酶突变体，混合均匀后在27℃～55℃下反应即可。
[0026]在某一方案中，所述的胺化反应结束后还包括以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法，其包括如下步骤：在氨基转移酶突变体的存在下，将化合物I和氨基供体在反应溶剂中进行胺化反应，得到化合物II即可；其中，R1为
‑
CHO；R2为
‑
Me；所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第3位、第4位、第5位、第7位、第15位、第19位、第25位、第29位、第32位、第48位、第51位、第56位、第58位、第59位、第60位、第61位、第69位、第77位、第84位、第86位、第108位、第110位、第119位、第120位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第126位、第144位、第147位、第148位、第150位、第151位、第152位、第155位、第159位、第161位、第164位、第174位、第175位、第199位、第201位、第202位、第209位、第210位、第235位、第236位、第238位、第239位、第240位、第241位、第242位、第243位、第244位、第249位、第257位、第260位、第261位、第270位、第272位、第273位、第274位、第295位、第296位、第297位、第307位、第308位、第314位、第322位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位、第332位、第350位、第358位、第373位、第374位、第376位、第387位、第396位、第398位、第403位、第410位、第424位、第428位、第435位、第436位、第437位、第442位、第451位、第472位和第474位中的一个或多个。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的氨基供体为异丙胺、L
‑
丙氨酸、DL
‑
丙氨酸、L
‑
赖氨酸、DL
‑
赖氨酸、(S)
‑1‑
苯乙胺、(R)
‑1‑
苯乙胺、(RS)
‑1‑
苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺、2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种；较佳地，所述氨基供体为异丙胺；(2)所述的氨基供体与所述的化合物I的摩尔比为(1～5):1，例如1:1、2:1或4:1；(3)所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液，或缓冲液和有机溶剂的混合物，所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、1,4
‑
二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；(4)所述的氨基转移酶突变体与所述的化合物I的质量比为1:(1
‑
2)，例如1:2；(5)所述的胺化反应的pH值为6.0～10.5；优选为7.0～9.0；例如7.0、8.0或9.0；(6)所述的胺化反应的反应温度为27℃～55℃(例如27℃、37℃或47℃)优选为47℃；(7)所述的胺化反应的反应时间为16～20h；例如16h；(8)所述的差异为缺失、增加或替换。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)当所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液和有机溶剂的混合物时，所述的有机溶剂占反应总体积的比例为0～250mL/L；
(2)所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液；(3)所述的缓冲液为硼酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(TRIS)和三乙醇胺盐缓冲液(TEOA)中的一种或多种；优选为磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液；(4)所述的缓冲液与所述的化合物I的体积质量比为10～50mL/g，例如10mL/g、20mL/g或50mL/g。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的手性内酰胺类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述的缓冲液和所述的氨基供体的混合液中，加入化合物I和所述的氨基转移酶突变体，混合均匀后在27℃～55℃下反应即可；(2)所述的胺化反应结束后还包括以下后处理步骤：加入碱调节pH至13，加有机溶剂萃取，并除去有机溶剂即可。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的后处理步骤中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和叔丁基甲醚中的一种或多种，优选为二氯甲烷；(2)所述的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，例如氢氧化钾；(3)所述的除去有机溶剂的方式为减压蒸馏，例如在压力为
‑
0.09Mpa下减压蒸馏。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基转移酶突变体在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第003位氨基酸残基突变为N、R、G、F、V、M、S、C、W、I、L、A、H、K、P、Y、Q、D或T，和/或，第004位氨基酸残基突变为A、H、Y、Q、V、M、F、C、D、W、G、I、E、S或T，和/或，第005位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、K、M、V、R、G、S、C、D、E、T或L，和/或，第007位氨基酸残基突变为A、P、Y、K、Q、M、N、V、C、D、W、R、E、F、T或L，和/或，第015位氨基酸残基突变为A、H、K、Q、V、F、G、S、C、R、E或T，和/或，第019位氨基酸残基突变为A、P、Y、N、V、R、G、F、S、M、E、I、T或L，和/或，第025位氨基酸残基突变为A、H、Y、K、N、M、R、V、D、W、F、I、G、C、S、T或L，和/或，第029位氨基酸残基突变为A、P、H、Q、K、N、M、F、R、C、G、V、E、S、T或L，和/或，第032位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、Q、M、F、R、D、G、C、I、W、E、T或L，和/或，第048位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、V、M、R、G、D、C、S、I、E、N或T，和/或，第051位氨基酸残基突变为A、P、Y、Q、V、M、R、S、D、E、I、T或L，和/或，第056位氨基酸残基突变为A、Q、K、V、M、R、C、D、G、E、T或L，和/或，第058位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、K、N、V、R、C、D、S、G、E、I、W或L，和/或，第059位氨基酸残基突变为A、P、H、K、M、V、F、S、D、W、I、E、T或L，和/或，第060位氨基酸残基突变为A、H、K、N、V、R、G、M、F、W、S、I、D、T或L，和/或，第061位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、M、V、F、S、D、C、G、E、N、I或L，和/或，第069位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、N、V、M、G、D、C、S、I、W、F、R、T或L，和/或，第077位氨基酸残基突变为P、H、Y、K、Q、V、M、F、C、S、W、N、E、I、G、T或L，和/或，第084位氨基酸残基突变为M、A、P、Y、Q、V、N、F、C、R、D、S、E、W、G、T或L，和/或，第086位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、N、M、R、C、G、F、V、D、E、T或L，和/或，第108位氨基酸残基突变为H、Y、Q、N、M、R、C、D、S、I、T或L，和/或，第110位氨基酸残基突变为P、H、Y、K、N、V、M、R、D、W、G、I、E、C、F、S或L，和/或，第119位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、V、N、F、G、S、D、M、I、W、R、T或L，和/或，第120位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、N、M、F、G、S、W、D、V、T或L，和/或，第121位氨基酸残基突变为P、H、Y、V、K、N、M、R、S、D、G、W、C、I、E、F、T
或L，和/或，第122位氨基酸残基突变为R、F、G、E、V、M、S、C、W、I、L、A、H、K、P、Y、Q、D或T，和/或，第123位氨基酸残基突变为A、P、H、K、Q、N、V、F、S、C、D、M、I、E、G或T，和/或，第124位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、Q、V、M、R、C、S、W、G、E、T或L，和/或，第125位氨基酸残基突变为A、H、Y、K、Q、M、N、R、C、S、W、G、I、F、V、T或L，和/或，第126位氨基酸残基突变为P、H、Q、M、F、S、D、R、E、T或L，和/或，第144位氨基酸残基突变为N、R、G、F、E、V、C、S、W、I、L、A、H、K、P、Y、Q、D或T，和/或，第147位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、Q、M、N、F、S、D、V、C、I、E、G、T或L，和/或，第148位氨基酸残基突变为A、Q、K、N、M、R、S、G、D、C、E、V、I、W或L，和/或，第150位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、N、M、R、G、F、W、I、E、T或L，和/或，第151位氨基酸残基突变为A、P、H、Q、K、M、V、F、C、S、W、G、E、I或R，和/或，第152位氨基酸残基突变为P、H、Y、N、M、V、R、S、D、C、G、E、I、F或L，和/或，第155位氨基酸残基突变为N、F、G、E、V、M、S、C、W、I、L、A、H、K、P、Y、Q、D或T，和/或，第159位氨基酸残基突变为A、H、Y、Q、K、N、M、F、C、R、G、W、I、D、S、T或L，和/或，第161位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、M、V、R、S、G、W、E、T或L，和/或，第164位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、Q、K、V、M、F、G、D、C、W、I、E、S、T或L，和/或，第174位氨基酸残基突变为A、P、H、Q、K、V、M、F、G、D、N、R、I、E、S、C、T或L，和/或，第175位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、K、Q、V、M、F、G、D、C、R、E或L，和/或，第199位氨基酸残基突变为A、P、H、Y、V、N、F、S、C、W、M、I、G、E或L，和/或，第201位氨基酸残基突变为A、K、Q、M、N、R、S、F、D、W、E、V、I、G、T或L，和/或，第202位氨基酸残基突变为A、H、Y、Q、K、M、N、V、C、D、W、...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱露，孟枭，王南，孙丰来，朱景仰，
申请(专利权)人：上海合全药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：