百日咳鲍特菌显色培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及百日咳鲍特菌显色培养基及其应用。本发明专利技术提供对样本中的百日咳鲍特菌同时进行分离培养和鉴定的显色培养基，所述培养基不仅能够实现百日咳鲍特菌的特异性显色，且缩短了其培养时间，简化操作，缩短流程，节省时间，并能获得百日咳鲍特菌培养物。本发明专利技术所述培养基适用于分离获株的培养和鉴定。培养和鉴定。

【技术实现步骤摘要】
百日咳鲍特菌显色培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及百日咳鲍特菌显色培养基及其应用。

技术介绍

[0002]百日咳是一种由百日咳鲍特菌引起的急性呼吸道传染病，因病程可迁延数月，所以称为“百日咳”。患者可表现为阵发性痉挛性咳嗽，且伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声，严重者会引起死亡。通常情况下5岁以下儿童高发，婴儿更容易发展成为重症，病死率高达10％。20世纪初，随着疫苗的研发和广泛使用，在实施扩大计划免疫的欧美国家，百日咳的发病率下降了90％以上，病死率也大幅下降，百日咳得到有效控制。然而，自20世纪90年代起欧美多国出现百日咳暴发疫情，在疫苗高覆盖的情况下，婴幼儿发病率升高，同时出现青少年及成人病例，欧美国家将百日咳流行趋势的变化称为“百日咳再现”。近年我国百日咳的发病率也呈现上升的趋势，2017年中国百日咳报告病例达10390例，2017～2019年已经连续三年报告病例持续增加。值得特别关注的是，己接种疫苗的青少年和成人患百日咳的病例逐渐增多，由于青少年和成人病例的临床症状不典型而导致误诊，而且这些病例往往是婴幼儿百日咳的重要传染源。因此，百日咳鲍特菌的培养和鉴定具有非常重要的临床意义，现有的检测方法有细菌培养法、免疫学检测方法、分子生物学方法等方法。
[0003]1.细菌培养法
[0004]病原体培养检测是诊断百日咳鲍特菌感染的“金标准”。百日咳鲍特菌营养要求高，对生长过程中产生的脂肪酸、重金属离子、过氧化物等代谢产物敏感，影响其生长，需在含碳、血液、淀粉等成分的培养基上生长，如鲍金氏培养基、百日咳活性炭培养基等。培养后的细菌鉴定也存在困难，常规细菌鉴定仪无法做出准确的鉴定，国内多以血清凝集反应鉴定为主，也可以进行质谱鉴定。目前培养法检测百日咳鲍特菌，样本先接种于百日咳选择性培养基，置于37℃孵箱，3d后开始每天检查培养皿，直至14d。若见灰白色、圆形、半透明的疑似菌落，则进行革兰染色、触酶试验和百日咳杆菌血清玻片凝集试验。显微镜显示为革兰染色阴性的短小杆菌，触酶阳性，经百日咳血清凝集试验确认为阳性的菌落为百日咳杆菌，或者质谱检测鉴别百日咳鲍特菌。百日咳鲍特氏菌生长缓慢，培养耗时较长，培养时间需2～3周，由于所需时间较长，容易造成培养过程中杂菌尤其是真菌污染。
[0005]2.免疫学检测方法
[0006]2.1直接荧光抗体测定(DFA)
[0007]DFA操作简单，费用低廉，但其特异性变化大，灵敏度不高，结果判定带有主观性，荧光易淬灭，且还存在与鼻咽部其他病原体的交叉反应，因此在临床应用中需结合疑似患者的症状，并与其他相关实验结果共同判断作出诊断，目前已经不推荐用于百日咳的诊断。
[0008]2.2血清学检测
[0009]百日咳鲍特菌感染后或免疫接种后，机体针对百日咳抗原产生不同抗体，可用血清学检测。百日咳毒素(pertussis toxin，PTx)为百日咳鲍特菌特有的抗原，易于检测标准化。血清学检测最佳时间是咳嗽发作后2～8周，此时抗体滴度处于最高水平，对于疾病的后
期阶段的诊断更有用。对近期接种过百日咳菌苗的疑似患者进行血清学诊断时应谨慎，需结合其临床症状、急性期和恢复期血清进行对比等做出诊断。另外血清学检测婴儿百日咳诊断中并不适用，国外研究显示，在婴儿组，经培养或PCR检测确诊百日咳的有82.2％，而通过PTx血清学检测阳性的仅39.6％。
[0010]血清学检测方法也一直是流行病学调查的重要手段。然而，血清学检测常对于病程晚期的百日咳临床诊断更有用。
[0011]3.分子生物学检测方法
[0012]随着分子生物技术的发展，PCR技术逐渐应用于百日咳感染的检测，其敏感性高、特异性较好，阳性检出率高，耗时短，是一种快速、准确、灵敏度高与特异性强的检测方法。PCR法检测百日咳鲍特菌的阳性率高于细菌培养，但该方法也存在一定局限性，如取材拭子上细菌含量少、细菌靶基因未能提取到等原因。不同厂家生产的检测试剂所针对的特定检测序列存在较大差异，目前主要的靶基因序列有插入序列IS481、IS1001、IS1002、百日咳毒素基因上游启动区域、百日咳黏附素、外膜孔蛋白等，且百日咳毒素不同的靶序列检测特异性存在一定差别。PCR技术还需注意假阳性问题，因为靶序列并非百日咳鲍特菌所特有，鲍特菌属其他细菌也存在相同序列。近年来用于百日咳诊断的PCR技术主要有多重PCR(MultiplexPCR)、套式PCR(Nested primers PCR)、实时PCR(Real time PCR)等。
[0013]培养法检测百日咳鲍特菌，阳性检出率低，操作过程比较复杂，培养周期长，需2～3周才能出结果，有些患者往往已经痊愈，培养试验结果才能获得，不能及时为百日咳临床诊断治疗提供帮助，且由于所需时间较长，容易造成培养过程中杂菌尤其是真菌污染，且临床样本中杂菌干扰较多，百日咳生长容易被杂菌掩盖，而且选择可疑菌落(白色、圆形、半透明的疑似菌落)对检验人员的经验要求较高，易漏检。培养后需进行血清凝集试验或者质谱检测，才能实现对百日咳鲍特菌的鉴定。
[0014]直接荧光抗体测定(DFA)特异性变化大，灵敏度不高，结果判定带有主观性，荧光易淬灭，且还存在与鼻咽部其他病原体的交叉反应，目前已经不推荐用于百日咳的诊断。
[0015]血清学检测方法虽灵敏度和特异度较高，简便快速，但该法对急性期患者不敏感，并且对于近期接种过百日咳疫苗的患者无法作出准确诊断。人百日咳IgG(PT
‑
IgG)诊断百日咳最为敏感，但检测时需采集双份血清检测其中PT
‑
IgG，若第二份血清中抗体水平比第一份升高3～4倍则诊断为百日咳的准确率大幅提高。但在实际操作中，采集双份血清较为困难，因此目前多数国家采用不同的血清PT
‑
IgG界值进行单份血清检测。
[0016]PCR方法的准确性与厂家生产的检测试剂所针对的特定检测序列有关，不同厂家选择的特定检测序列存在较大差异，不同的靶序列检测特异性存在一定差别，且有些靶序列并非百日咳鲍特菌所特有，鲍特菌属其他细菌也存在相同序列，从而影响产品的特异性。PCR法检测无法获取培养菌落，不能进行后续的确认验证，因此其假阳性无法排除。
[0017]以上除了培养法之外，抗体检测、血清学检测、PCR检测等均无法区分百日咳鲍特菌是否存活，且无法获得培养物，不能进行后续的验证试验和药敏检测。

技术实现思路

[0018]有鉴于此，本专利技术提供了百日咳鲍特菌显色培养基及其应用。本专利技术提供了对样本中的百日咳鲍特菌同时进行培养和鉴定的显色培养基，易于配置，缩短流程，培养周期
短，培养72h即可根据培养颜色变化判断结果，特异性强、选择性好。本专利技术也适用于分离获株的培养和鉴定。
[0019]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0020]本专利技术提供了培养基，其包括胰酪胨、明胶胨、酸水解酪蛋白、牛肉粉、甘油磷酸钠、甘露醇、MOPS、氯化钙、L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.培养基，其特征在于，包括胰酪胨、明胶胨、酸水解酪蛋白、牛肉粉、甘油磷酸钠、甘露醇、MOPS、氯化钙、L
‑
谷氨酸钠、磷酸氢二钾、丙酮酸钠、铜盐、磷酸酶底物、大豆卵磷脂、抑菌剂、L
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半胱氨酸盐酸盐、NAD和琼脂粉。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括水。3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述铜盐包括硫酸铜和/或氯化铜。4.如权利要求1至3任一项所述的培养基，其特征在于，所述磷酸酶底物包括：(I)、5
‑
溴
‑6‑
氯
‑
3吲哚
‑
磷酸、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑
3吲哚
‑
磷酸和/或6
‑
氯
‑
3吲哚
‑
磷酸；和/或(II)、(I)相应的盐；所述(I)相应的盐包括5
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溴
‑6‑
氯
‑
3吲哚
‑
磷酸对甲苯铵盐和/或5
‑
溴
‑4‑
氯
‑
3吲哚
‑
磷酸钠盐。5.如权利要求1至4任一项所述的培养基，其特征在于，所述抑菌剂包括头孢氨苄、万古...

【专利技术属性】
技术研发人员：王利英，孟圆圆，李晓霞，刘亚峰，王则宇，汪礼琴，秦军领，杨红云，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：