一种纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法及维生素K2的制备方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵领域，涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法及维生素K2的制备方法。本发明专利技术提供的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法包括将纳豆枯草芽孢杆菌依次进行菌种活化和种子培养，在种子培养之前，先将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理，并且在种子培养过程中，待OD

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法及维生素K2的制备方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法及维生素K2的制备方法。

技术介绍

[0002]维生素K2是一种必不可少的脂溶性维生素，也称为甲萘醌，它可以通过促进肝脏合成凝血酶原，调节多种凝血因子的合成，也是骨钙素羧化的必要辅因子，在骨骼发育中起到重要作用，并有助于将钙离子转移到骨骼中，在凝血和预防骨质疏松症中能够起到关键的作用。另外，作为呼吸代谢中的电子传递载体，维生素K2也参与了生物体内许多重要的代谢反应。近年来的研究发现，维生素K2在临床应用上还有许多不同的功能，例如，不仅可用来预防治疗心脑血管疾病、帕金森症及II型糖尿病等，而且还可促进肝脏功能恢复，具有广阔的应用前景。
[0003]目前，维生素K2的生产来源主要有三种：(1)提取法，也即从植物、或动物中提取；(2)化学合成法；(3)微生物发酵法。其中，提取法产量低。化学合成法步骤复杂、收率低，并且化学合成法易产生低活性的不同顺式异构体及大量的副产物，并造成环境污染，较难形成大规模的生产。而微生物发酵法具有污染小、成本低、产品活性高、生产规模易于放大等特点，在维生素K2的生产方法中逐渐脱颖而出。然而，现阶段对维生素K2生产过程的研究主要集中在菌体选育及基因改造上面，而对于发酵工艺特别是菌株扩培备种优化上的研究较少。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的在于提供一种新的能够提高维生素K2发酵水平和发酵产量的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法。
>[0005]本专利技术的第二目的在于提供一种维生素K2的制备方法。
[0006]具体地，本专利技术提供的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，该方法包括将纳豆枯草芽孢杆菌依次进行菌种活化和种子培养，在种子培养之前，先将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理，并且在种子培养过程中，待OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至3.5～4.5。
[0007]本专利技术提供的维生素K2的制备方法包括采用上述纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法制备种子液，再将所述种子液进行发酵培养。
[0008]纳豆枯草芽孢杆菌的最适生长pH值为5～9，且在发酵生产维生素K2过程中，会积累一定量的乳酸。现有技术中采用纳豆枯草芽孢杆菌发酵产维生素K2时通常采用偏中性pH条件，发酵温度通常为30～40℃，更高的发酵温度会对菌体的生长会造成不利影响。本专利技术的专利技术人经过深入且广泛研究之后发现，乳酸浓度过高会抑制菌体生长代谢，产物维生素K2在酸性及较高温(40～50℃)条件下较为稳定。即，如何控制或消除乳酸对菌体生长代谢的不良影响，以及如何解决菌体在酸性、高温环境下的生长抑制问题，是提高维生素K2发酵
水平和稳定性的关键所在。本专利技术的专利技术人经过进一步的研究发现，在纳豆枯草芽孢杆菌的备种阶段，在种子培养之前，先将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理，并且在种子培养过程中，待OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至3.5～4.5，这样能够提高发酵过程中菌体在酸性以及乳酸环境下的耐受能力，改善菌体在发酵过程中的生长状况和产物代谢能力，并有利于提高维生素K2的发酵水平及稳定性，实现发酵产量的明显提高，降低物料成本。
[0009]在一种优选实施方式中，在种子培养过程中，当第一培养条件的温度低于第二培养条件的温度且第二培养条件的温度低于二级摇瓶培养的温度时，能够实现各级摇瓶培养温度的逐渐提高，使得菌种能够适应发酵过程的高温条件，而维生素K2本身在高温环境下就较为稳定，因此此时各方面的条件均有利于维生素K2发酵水平的进一步提高。
[0010]在一种优选实施方式中，当将发酵培养的pH值控制在3.5～4.5和/或发酵培养的温度为40～50℃时，可以更有效地避免发酵体系中维生素K2的分解或副反应的产生，提高稳定素K2的稳定性，从而更有利于发酵液中维生素K2含量的提高。
具体实施方式
[0011]本专利技术提供的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法包括将纳豆枯草芽孢杆菌依次进行菌种活化和种子培养，其中，在种子培养之前，先将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理，并且在种子培养过程中，待OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至3.5～4.5。
[0012]在纳豆枯草芽孢杆菌的备种过程中，需要先将纳豆枯草芽孢杆菌进行菌种活化，得到成熟的单菌落。具体操作过程一般为在无菌条件下，将纳豆枯草芽孢杆菌种子冻存液按照梯度稀释方法接入平板培养基中，于温度28～40℃下培养15～25h。其中，所述平板培养基的种类可以为本领域的常规选择，例如，可以为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基等。
[0013]在纳豆枯草芽孢杆菌的备种过程中，将菌种活化之后且种子培养之前，需要将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理。在一种优选实施方式中，所述预处理的方法包括将单菌落放入含双氧水的生理盐水中混均后静置，再将所得静置液进行离心分离，之后将所得固态产物重悬于不含双氧水的生理盐水中得到重悬菌液，此时能够更充分地激活菌体的抗氧化活性，促进产物合成。其中，所述静置的条件优选包括温度为室温(20～40℃，如20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃或它们之间的任意值)；时间为1～5h，如1h、2h、3h、4h、5h或它们之间的任意值。所述含双氧水的生理盐水中双氧水的含量优选为0.5～3v/v％，如0.5v/v％、1v/v％、1.5v/v％、2v/v％、2.5v/v％、3v/v％或它们之间的任意值。
[0014]在纳豆枯草芽孢杆菌的备种过程中，在种子培养过程中，待OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至3.5～5.0，如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或它们之间的任意值。
[0015]在一种优选实施方式中，所述种子培养包括依次进行的一级摇瓶培养和二级摇瓶培养，在一级摇瓶培养过程中，在第一培养条件下培养至OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至4.0～5.0(如4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或它们之间的任意值)，再在第二培养条件下继续培养，之后将所得培养液以1～10％(如1％、2％、3％、4％、5％、
6％、7％、8％、9％、10％或它们之间的任意值)的接种量转入二级摇瓶中并采用乳酸调节pH值至3.5～4.5(如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5或它们之间的任意值)进行二级摇瓶培养。采用以上优选的方式进行种子培养，能够更有效地提高菌体对酸性条件及乳酸环境的耐受活性，从而更有利维生素K2发酵水平的提高。
[0016]在纳豆枯草芽孢杆菌的备种过程中，优选地，所述第一培养条件的温度低于第二培养条件的温度，且所述第二培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，该方法包括将纳豆枯草芽孢杆菌依次进行菌种活化和种子培养，其特征在于，在种子培养之前，先将菌种活化所得单菌落采用含双氧水的生理盐水进行预处理，并且在种子培养过程中，待OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至3.5～5.0。2.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，其特征在于，所述预处理的方法包括将单菌落放入含双氧水的生理盐水中混均后静置，再将所得静置液进行离心分离，之后将所得固态产物重悬于不含双氧水的生理盐水中得到重悬菌液。3.根据权利要求2所述的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，其特征在于，所述静置的条件包括温度为室温，时间为1～5h。4.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，其特征在于，所述含双氧水的生理盐水中双氧水的含量为0.5～3v/v％。5.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，其特征在于，所述种子培养包括依次进行的一级摇瓶培养和二级摇瓶培养，在一级摇瓶培养过程中，在第一培养条件下培养至OD
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≥0.5时，采用乳酸调节pH值至4.0～5.0，再在第二培养条件下继续培养，之后将所得培养液以1～10％的接种量转入二级摇瓶中并采用乳酸调节pH值至3.5～4.5进行二级摇瓶培养。6.根据权利要求5所述的纳豆枯草芽孢杆菌的备种方法，其特征在于，所述第一培养条件的温度低于第二培养条件的温度，且所述第二培养条件的温度低于二级摇瓶培养的温度；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟锦潮，蒋四富，陈必钦，严必能，孟晓雪，李丹，徐鲁明，吴轶，詹光煌，
申请(专利权)人：厦门金达威集团股份有限公司金达威生物技术江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：