一种用于单个胚胎痕量蛋白提取的前处理方法技术

本发明专利技术涉及生物技术与蛋白质组学技术领域，尤其涉及一种用于筛选冷冻保存/新鲜体外受精胚胎差异蛋白的方法，包括以下步骤：(1)冷冻保存/新鲜胚胎培养；(2)痕量胚胎蛋白提取与酶解；(3)通过液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种用于单个胚胎痕量蛋白提取的前处理方法


[0001]本专利技术涉及生物技术与蛋白质组学
，尤其涉及一种痕量非标记蛋白质组学的前处理新技术，可用于分析受精胚胎间差异表达蛋白进而筛选冷冻保存/新鲜体外胚胎。

技术介绍

[0002]针对动物植入前胚胎的研究有助于阐明胚胎的细胞功能以及胚胎发育过程中体内生物分子的变化情况。已有很多针对动物胚胎的基因表达分析为研究胚胎活性提供了丰富信息，但是基因并不能准确预测蛋白质在生化水平上发挥功能的信息。作为在生理学过程中发挥核心作用的蛋白质，研究其丰度和活性至关重要。
[0003]目前对动物胚胎的蛋白质研究主要集中在识别单个或几个蛋白质上，然而，生理过程涉及多种蛋白质的相互作用，仅针对单个蛋白质进行研究存在很大的局限性。对胚胎进行非标记蛋白质组学可以更全面的了解细胞的功能信息。检测痕量的胚胎蛋白是非常具有挑战性的，经典的蛋白质组学方法涉及2D聚丙烯酰胺凝胶电泳，不但需要大量的起始材料、操作复杂且无法进行高通量分析。
[0004]质谱技术作为一种高灵敏度、高通量且低成本的方法使得对胚胎的非标记蛋白质组学的研究成为可能。液相色谱
‑
串联质谱联用(LC
‑
MS/MS)技术和表面增强激光解吸和电离飞行时间质谱(SELDI
‑
TOF MS)已被用于胚胎的非标记蛋白质组学检测并且取得不错的检测效果。但是受限于胚胎的低样本量、低蛋白质丰度以及现有仪器的低灵敏度，目前检测还是使用多个胚胎的混合样本，无法实现对单个胚胎蛋白质组学的检测。不同胚胎存在显著的个体差异，对单个胚胎的蛋白质组学检测可以更准确的反应胚胎生长发育的信息，帮助临床挑选最具生殖潜力的胚胎进行移植。所以我们急需构建一种快速、高效的非标记蛋白质组学检测方法，实现对单个胚胎细胞全面的蛋白质组学检测。
[0005]在过去四十年中，辅助生殖技术(ARTs)已日趋成熟，为众多不孕症患者带来福音。但低植入率、低妊娠率以及婴儿的出生缺陷、生长障碍等疾病依旧阻碍着辅助生殖技术的发展。我们无法判断这种疾病风险是胚胎质量不佳导致的还是体外受精技术所带来的副作用。目前大多数的研究集中在如何判别胚胎质量、提高植入率上，对体外受精技术是否影响胚胎发育/植入潜力的研究少之又少。已有部分研究认为体外受精胚胎发育过程中周围环境压力有可能对胚胎的植入潜力和后续生长发育有潜在影响，研究这种影响有助于改进胚胎培养程序、提高胚胎的临床植入率。
[0006]根据欧洲人类生殖与胚胎学会的最新报道，冷冻保存胚胎技术是生育治疗中第二常用的技术。这种技术可以实现储存多余胚胎，为植入失败的患者进行二次植入提供了可能。但是冷冻胚胎技术会让胚胎暴露于低温和冷冻保护液的环境中，这可能会对胚胎造成潜在影响。已有研究表明，玻璃化胚胎移植过程涉及的技术对后代发育的影响有累加效应。与新鲜移植的体外受精胚胎相比，经过玻璃化操作的体外受精胚胎移植后所诞生的兔在成年期的生长速度、体重和重要器官重量都有不同
[6]。来自冷冻保存胚胎的小牛也表现出特
殊的临床和生化特征
[7]。
[0007]目前的研究主要集中在通过体内/体外冷冻保存胚胎移植后出生的胎儿的生理特征，还没有针对冷冻保存胚胎和新鲜胚胎的蛋白质组学差异的研究。质谱是一种高灵敏度、高通量的蛋白质组学研究工具，可以实现对胚胎不同发育阶段全面的蛋白检测。由于胚胎的体积小、蛋白质丰度低，导致针对单个冷冻/新鲜胚胎的非标记蛋白质组学检测难度大，所以还没有针对冷冻/新鲜体外受精胚胎的蛋白质组学或筛选差异表达蛋白的相关研究报道。
[0008]在这里，我们开发了一种基于液相色谱
‑
质谱联用(LC
‑
MS/MS)技术的非标记蛋白质组学检测方法，用于分析单个胚胎的蛋白质组学。该策略适用于发育不同阶段胚胎的蛋白质表达检测，用于确定不同阶段的特异性蛋白以及筛选差异表达的潜在蛋白标志物，最终为临床移植的胚胎选择提供帮助。目前还没有此方面的专利发表。该技术适用于筛选植入前发育不同阶段的冷冻/新鲜胚胎中特异性蛋白以及差异表达蛋白，为临床提供可以实现多指标评估胚胎质量的蛋白标志物。
[0009]目前国内外关于胚胎样本差异表达蛋白的研究也有不少，Deisy J.D等人
[1]基于液相色谱
‑
质谱联用(LC
‑
MS/MS)技术对体内受精六天龄的处于桑葚和囊胚发育状态的54个绵羊胚胎混合样本进行了蛋白质组学分析。通过四种软件共鉴定出667种蛋白质，Jos
é
Renato S等人
[2]利用一维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)结合液相色谱
‑
质谱联用(LC
‑
MS/MS)技术对植入前六天龄(D6)的绵羊胚胎样本进行了蛋白质组学检测，从45个胚胎的混合样本中共鉴定出2262种蛋白质。Charles Banliat等人
[3]利用纳米液相色谱结合串联质谱(nanoLC
‑
MS/MS)分析5个不同阶段的牛胚胎混合样本，共鉴定出2757种蛋白质，其中1950种进行了定量分析。Gao等人
[4]基于串联质量标签(TMT)的定量质谱技术监测了植入前六个不同阶段小鼠胚胎的蛋白质表达谱，每个阶段使用8000个胚胎，共检测到4000多种蛋白质。Mandy G等人
[5]第一个利用表面增强激光解吸和电离飞行时间质谱(SELDI
‑
TOF MS)分析了单个人类囊胚的蛋白质组，在发育中的囊胚和已退化胚胎之间观察到几种差异表达蛋白。但只展示了差异代谢物，并未展示具体检测出的蛋白质名称和数量。Ximo Garcia
‑
Dominguez等人
[7]首次通过液相色谱
‑
质谱联用(LC
‑
MS/MS)技术对经过玻璃化移植胚胎出生的兔和自然受孕的兔的肝组织进行蛋白质组学分析，筛选出与产后结局相关的差异表达蛋白。(Long
‑
Term Phenotypic and Proteomic Changes Following Vitrified Embryo Transfer in the Rabbit Model)Ximo Garcia
‑
Dominguez等人
[8]利用液相色谱
‑
电喷雾电离
‑
高分辨率质谱(LC
‑
ESI
‑
HRMS)和液相色谱
‑
大气压化学电离
‑
高分辨率质谱(LC
‑
APCI
‑
HRMS)对兔胚胎进行了标记和非标记的代谢组学分析。样本来源于自然受孕/新鲜/玻璃化胚胎移植后在体内发育第六天的胚胎混合样本。结果表明，三个实验组中共有40种代谢物的积累量下降，胚胎移植/冷冻操作都发挥了累积效应。
[0010]因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于单个胚胎痕量蛋白提取的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集含有胚胎细胞的悬液；(2)加入4倍体积的十二烷基β
‑
D
‑
麦芽苷(DDM)裂解缓冲液，在室温下水浴超声裂解1h；(3)将步骤(2)裂解后的样品在金属浴中加热1h还原蛋白质，室温下黑暗处反应30min使蛋白质发生烷基化反应，向溶液中直接加入胰蛋白酶，用封口膜封口，进行酶解反应，放入37℃的烘箱过夜孵育12
‑
16小时；(4)向步骤(3)酶解后的样品加入终体积的1％的甲酸(FA)终止反应，涡旋混匀；(5)通过Ziptip C18微量层析柱对样本进行脱盐处理；(6)用真空干燥仪干燥样品，放置于
‑
20℃备用。2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述裂解缓冲液为：40
‑
60mM碳酸氢铵溶液、0.05
‑
0.2％DDM、0.5
‑
2mM三(2
‑
羧基乙基)磷化氢(TECP)和1
‑
3mM 2
‑
氯乙酰胺(CAA)。3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述酶解步骤中W胰酶:W蛋白的比例为1:5
‑
20。4.权利要求1
‑
3所述前处理方法筛选冷冻保存/新鲜体外受精胚胎间差异表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)冷冻保存/新鲜胚胎培养；(2)痕量胚胎蛋白提取与酶解；(3)通过液相色谱
‑
串联质谱联合技术进行非标定量的胚胎蛋白检测；(4)筛选冷冻保存/新鲜胚胎之间的差异表达蛋白并进行生物信息学分析。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述胚胎来自绵羊，牛，小鼠，人，兔；更优选地，所述胚胎来自小鼠。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，沈广霞，邓淑欣，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：