一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法技术

本发明专利技术公开了一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，包括以下步骤：将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；用链霉蛋白酶消化；用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，荧光标记的山羊抗鼠IgG和荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，荧光标记的山羊抗鼠IgG和荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况，该方法能够直观的分析同源染色体是否存在不完全联会或重组次数异常等情况。或重组次数异常等情况。或重组次数异常等情况。

【技术实现步骤摘要】
一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法


[0001]本专利技术涉及一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法。

技术介绍

[0002]卵母细胞的第一次减数分裂进程包括前期、中期，后期和末期，前期所占时间最长，包括细线期，偶线期，粗线期和双线期，其中粗线期维持的时间又是最长的。在偶线期和粗线期完成了染色体发生了剧烈的形态和和结构变化，主要包括同源染色体的联会或重组，该过程一旦出错便可导致卵母细胞质量下降或非整倍体改变。
[0003]但目前分析联会或重组的技术方法主要依赖蛋白印迹或免疫组化等方法，此种方法不能直观的看到同源染色体的联会，更不能分析同源染色体间的重组位点等情况，只能定性的分析参与联会或重组过程中蛋白的表达情况。另外处于第一次减数分裂前期的卵母细胞获取困难，且外围有一层透明带，会干扰细胞的低渗和涂片后的细胞破裂，导致分裂相或者联会复合体聚集不分散，荧光染色后不能有效直观的分辨未完全联会的染色体数量，同源染色体非姐妹染色单体间的重组情况等指标，在一定程度上限制了对减数分裂进程的深入研究。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，该方法能够直观的分析同源染色体是否存在不完全联会或重组次数异常等情况。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；
[0008](2)用链霉蛋白酶的溶液重悬细胞，并经孵育、离心后收集沉淀；
[0009](3)用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；
[0010](4)以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或，以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。
[0011]步骤(1)中，蔗糖溶液的浓度为0.02～0.5M。
[0012]步骤(2)中，链霉蛋白酶的溶液质量浓度为0.05～0.6％，所述链霉蛋白酶的溶液
通过将链霉蛋白酶溶解在M2溶液中得到；所述孵育的条件为35～37℃孵育5～20分钟。
[0013]步骤(3)中，含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液中，十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的质量浓度分别为0.01～0.1％、0.1～0.5％、0.5～4％。
[0014]步骤(3)中还包括：将固定后的载玻片置入洗涤液中清洗，然后每张玻片滴加封闭液，置于饱和湿度的暗盒中封闭2～8小时。
[0015]步骤(4)中，检测初级卵母细胞的同源染色体间的联会时，进行以下步骤：
[0016](a)用稀释液按照1:100～1:300的比例稀释羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体，然后滴加在载玻片上，4℃孵育10～15小时；
[0017](b)去除一抗残余液体，将玻片置于洗涤液中进行清洗；
[0018](c)用稀释液按照1:500～1:1000的比例稀释Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗，将二抗滴加到载玻片上，覆盖封口膜，置于饱和湿度暗盒中，室温孵育1～4小时；
[0019](d)去除二抗残余液体，将玻片置于洗涤液中清洗，然后在载玻片上滴加抗荧光猝灭剂，加盖盖玻片，玻片周围进行固定，然后置于正置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察同源染色体间的联会。
[0020]步骤(4)中，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况时，进行以下步骤：
[0021](A)用稀释液按照1:100～1:300的比例稀释羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体，然后滴加在载玻片上，4℃孵育10～15小时；
[0022](B)去除一抗残余液体，将玻片置于洗涤液中进行清洗；
[0023](C)用稀释液按照1:500～1:1000的比例稀释Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗，将二抗滴加到载玻片上，覆盖封口膜，置于饱和湿度暗盒中，室温孵育1～4小时；
[0024](D)去除二抗残余液体，将玻片置于洗涤液中清洗，然后在载玻片上滴加抗荧光猝灭剂，加盖盖玻片，玻片周围进行固定，然后置于正置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。
[0025]所述封闭液为含1～2wt％的山羊血清、1～2wt％的牛血清白蛋白、0.001～0.01％ TritonX100的PBS溶液。
[0026]所述稀释液为含1～5wt％牛血清白蛋白、0.005～0.1wt％TritonX100的PBS溶液。
[0027]所述洗涤液为含0.05～1wt％Photo～Flo200的PBS溶液。
[0028]同源染色体的联合和重组是建立在联会复合体形成的基础上，联会复合体是一种介导同源染色体联会的特异性蛋白，由中央组分、侧生组分和L～C纤维组成，包含SYCP1、SCP2和SYCP3等多种蛋白，其中SYCP1和SYCP3分别位于中央组分和侧生组分，分析联会复合体可通过对这两种蛋白特异性染色，分辨是否有。同源染色体非姐妹染色单体在同源染色体联会的同时会发生同源重组，MLH1是一种DNA错配修复基因，在同源重组过程中发挥重要作用，可通过检测MLH1在联会复合体上数量间接的统计同源重组的位点及数量，本专利技术通过铺展技术将联会复合体松散的铺展在玻片上，对联会复合体的SYCP1蛋白和SYCP3蛋白、或SYCP3蛋白和MLH1联合荧光染色，便可以直观的分析同源染色体是否存在不完全联会或重组次数异常等情况。
[0029]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0030]1.本专利技术公开的方法选取了正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞，这样可以收集到第一次减数分裂前期中细线期、偶线期、粗线期和双线期的卵母细胞，且结合联会复合体能直观地分析同源染色体间的联会或重组情况，对于探究其机制具有重要作用。
[0031]2.本专利技术针对初级卵母细胞透明带的存在，使用蔗糖低渗液对初级卵母细胞进行重悬相较于常用的0.75％氯化钾渗透效果更好，其中0.02～0.5M的蔗糖低渗液除了可以使细胞吸水膨胀外，还可以保护细胞内DNA完整性，防止DNA的降解。
[0032]3.本专利技术在低渗之后利用链霉蛋白酶消化使透明带变薄，有利于卵母细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；(2)用链霉蛋白酶的溶液重悬细胞，并经孵育、离心后收集沉淀；(3)用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；(4)以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或，以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。2.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(1)中，蔗糖溶液的浓度为0.02～0.5M。3.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(2)中，链霉蛋白酶的溶液质量浓度为0.05～0.6％；所述孵育的条件为35～37℃孵育5～20分钟。4.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(3)中，含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的溶液中，十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的质量浓度分别为0.01～0.1％、0.1～0.5％、0.5～4％。5.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(3)中还包括：将固定后的载玻片置入洗涤液中清洗，然后每张玻片滴加封闭液，置于饱和湿度的暗盒中封闭2～8小时。6.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(4)中，检测初级卵母细胞的同源染色体间的联会时，进行以下步骤：(a)用稀释液按照1:100～1:300的比例稀释羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体，然后滴加在载玻片上，4℃孵育10～15...

【专利技术属性】
技术研发人员：高继光，余盈，侯文文，卜文婕，林爱琴，罗鑫，宋雅雯，陶志鹏，胡嵛堃，王宁，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：