一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法技术

本发明专利技术属于微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种假拟盘多毛孢属(Pseudopestalotiopsiscamelliae

【技术实现步骤摘要】
一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物遗传转化
，具体涉及一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。

技术介绍

[0002]假拟盘多毛孢属真菌是最常见的植物内生菌之一，Pseudopestalotiopsis camelliae
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sinensis P
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1菌株为茶树内生真菌，mCherry标记能在具有生命特征的寄主里表达形成生物发光蛋白，不伤害活细胞，不改变菌株致病性，荧光信号在荧光显微镜下检测到的光源单一且稳定。诸多研究者将不同真菌进行荧光蛋白基因标记以探究其侵染机制。
[0003]而对于假拟盘多毛孢属真菌侵染规律、互作机制及关键功能基因的研究鲜见报道，只有建立稳定高效的PEG介导的假拟盘多毛孢属真菌原生质体遗传转化体系，提升该菌遗传转化效率，可为后续研究该菌的功能基因以及与寄主的互作机制提供参考方案。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法，所裂解的原生质体数量适宜，质量好，步骤简便，可以提高后续遗传转化的转化效率。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；
[0007]将所述裂解液培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体；
[0008]优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(4.9～5.9)
×
106个/mL。
[0009]优选的，所述裂解的震荡频率为80～120rpm，温度为28～32℃，时间为10～30min。
[0010]优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌包括Pseudopestalotiopsis camelliae
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sinensis P
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1菌株。
[0011]优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌菌丝的制备方法包括：
[0012]将活化的假拟盘多毛孢属真菌菌株接种至PDB培养基中进行培养，得到菌丝球；所述PDB培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为28～32h。
[0013]将所述菌丝球进行研磨后接种至M3S培养基中进行菌丝培养，得到假拟盘多毛孢属真菌幼嫩菌丝；所述M3S培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～15h。
[0014]本专利技术还提供了上述技术方案所述的制备方法在构建假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系的构建方法，包括如下步骤：
[0016]采用上述技术方案所述的制备方法制备得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体；
[0017]将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体与STC溶液混合，得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液；
[0018]将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；
[0019]向所述第一原生质体溶液中逐滴加入SPTC溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；
[0020]将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基复苏，得到复苏的原生质体溶液；
[0021]将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，黑暗培养3～5d，得到假拟盘多毛孢属真菌转化子。
[0022]优选的，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液的体积、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒的质量和肝素钠溶液的体积的比值为50μL：5μg：1μL；所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液中假拟盘多毛孢属真菌原生质体的浓度为(0.98～11.8)
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104个/μL；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/mL。
[0023]优选的，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；pH值为7.0；
[0024]所述选择性培养基以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素。
[0025]优选的，所述抗生素标记基因包括潮霉素B抗性表达基因。
[0026]有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；将所述裂解液进行震荡培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体。本专利技术以酶解液对假拟盘多毛孢属真菌菌丝进行裂解制备假拟盘多毛孢属真菌原生质体，获得的原生质体数量多，质量好，且步骤简便易操作。以此方法获得假拟盘多毛孢属真菌原生质体可以快速有效地进行PEG介导的假拟盘多毛孢属真菌遗传转化，且转化效率较高。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029]图1为实施例1～3和对比例1中制备得到的裂解液中的假拟盘多毛孢属真菌原生质体数量统计图；
[0030]图2为实施例1～3和对比例1中制备得到的裂解液中的假拟盘多毛孢属真菌原生质体形态图；
[0031]图3为实施例4中的潮霉素B抗性筛选结果；
[0032]图4为测试例2中转化子中目的基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0033]图5为测试例2中荧光显微镜下观察转化子中的mCherry荧光图；
[0034]图6为实施例5中假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系的构建方法的流程图。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
[0036]将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；
[0037]将所述裂解液培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体；
[0038]在本专利技术中，对所述假拟盘多毛孢属真菌的菌株没有特殊限定，本领域中常规假拟盘多毛孢属真菌菌株均可以采用本专利技术中的制备方法制备原生质体，如本专利技术实施例中采用的是假拟盘多毛孢属真菌Pseudopestalotiopsis camelliae
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1菌株。
[0039]本专利技术优选制备假拟盘多毛孢属真菌菌丝，所述假拟盘多毛孢属真菌菌丝的制备方法优选包括：
[0040]将活化的假拟盘多毛孢属真菌菌株接种至PDB培养基中进行培养，得到菌丝球；所述PDB培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为28～32h。
[0041]将所述菌丝球进行研磨后接种至M3S培养基中进行菌丝培养，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；将所述裂解液培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(4.9～5.9)
×
106个/mL。3.根据权利要求1～2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌包括Pseudopestalotiopsis camelliae
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1菌株。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌菌丝的制备方法包括：将活化的假拟盘多毛孢属真菌菌株接种至PDB培养基中进行培养，得到菌丝球；所述PDB培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为28～32h。将所述菌丝球进行研磨后接种至M3S培养基中进行菌丝培养，得到假拟盘多毛孢属真菌幼嫩菌丝；所述M3S培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～15h。5.权利要求1～4任一项所述的制备方法在构建假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系中的应用。6.一种假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到假拟...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕务云，徐婷，王玉春，蒋鸿，涂一怡，曹清海，黄超，任恒泽，王新超，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：