一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用技术

本发明专利技术涉及一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用，涉及微生物技术领域，包括如下步骤：S1：培养枯草芽孢杆菌至平台期，离心，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清；S2：将所述枯草芽孢杆菌的培养上清加入灭菌后的螺旋藻的溶液中，裂解，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；S3:检测、调节所述螺旋藻的裂解液Ⅰ的pH，后依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，再次裂解，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅱ；S4:将所述螺旋藻的裂解液Ⅱ重复进行S3和再次裂解3～7次，获取所述螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清。本发明专利技术螺旋藻生物裂解的效率高，细菌培养效果佳，成本便宜，可推广到工业上进行大规模螺旋藻的裂解，用于细菌培养基的制作。用于细菌培养基的制作。用于细菌培养基的制作。

【技术实现步骤摘要】
一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用。

技术介绍

[0002]细菌由于其生长周期短、易于大规模培养等优点，被广泛运用于农业、工业、医学、科研等领域，如利用大肠杆菌原核表达系统来生产Taq酶。利用细菌进行科研基础研究和产业开发，需要事先对相关细菌进行分离和大规模培养，而细菌的分离培养依赖有效的细菌培养基。目前，细菌培养基制作主要经不完全的裂解动物(如牛肉、鱼肉、牛奶粉等)、植物(主要是大豆)和酵母等原料获得。这些原料本身比较贵，且成本正逐年递增，另外加上裂解成本在持续走高，因而培养基变得越来越贵，亟需寻找新的细菌培养基原料来源和低成本的裂解方法。
[0003]螺旋藻(学名Spirulina)属于蓝藻门、颤藻科下的一个属，是一种古老的低等单细胞或者多细胞水生植物，体长200～500微米，宽5～10微米。在显微镜下形态为螺旋丝状，故而得名为螺旋藻。其细胞结构简单，无细胞核，因而又称蓝细菌。螺旋藻营养物质丰富。首先，其蛋白质含量很高，是地球上最丰富的蛋白质来源之一，蛋白质含量约为60％～70％，远高于传统用于细菌培养基制作的原料，如鸡蛋、啤酒酵母、脱脂奶粉、鱼、大豆和牛肉等，且含有全部20种氨基酸。其次，螺旋藻含有丰富的维生素，包括维生素A、E、B1、B7和B8等。再则，螺旋藻含有所有细菌生长所需要的矿物质和微量元素，如锌、铁、钾、钙、镁、磷、硒、碘等。最后，螺旋藻所含单糖主要是鼠李糖(占总糖的53％)，而葡萄糖相对较低，有利于防止/减少生长抑制物
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乙酸的产生。因此，螺旋藻是细菌培养基制备的理想原料。此外，螺旋藻是一种光能自养微生物，成本低，且在进行光合作用时消耗大量二氧化碳，对环境友好，助力我国“双碳”计划的实现。
[0004]然而，将螺旋藻转变为可供细菌利用的培养基原料，难度很大。原因在于：(1)需要破坏螺旋藻细胞结构，充分释放细胞内容物，而螺旋藻特别是干粉螺旋藻细胞壁坚固，不易被破坏；(2)对大多数细菌来说，由于缺乏转运短肽的转运蛋白，因此理想的氮源为游离氨基酸；为此需要对破外的螺旋藻细胞进一步裂解为游离氨基酸，以提高细菌的培养效率。鉴于此，提供一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种螺旋藻生物裂解的方法及在细菌培养基中的应用。目的在于通过解生物裂解螺旋藻得到为可供细菌利用的培养基原料，成本低。
[0006]本专利技术为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种螺旋藻生物裂解的方法，包括如下步骤：
[0007]S1：培养枯草芽孢杆菌至平台期，离心至平台期的所述枯草芽孢杆菌，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；
[0008]S2：将所述枯草芽孢杆菌的培养上清加入灭菌后的螺旋藻的溶液中，在32～42℃下裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；
[0009]S3:检测所述螺旋藻的裂解液Ⅰ的pH，调节pH为6.5～7.5，在调节pH之后的所述螺旋藻的裂解液Ⅰ中依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，在32～42℃下再次裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅱ；
[0010]S4:将所述螺旋藻的裂解液Ⅱ重复进行所述S3的调节pH，依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，及再次裂解3～7次，裂解结束后离心获取所述螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清，备用。
[0011]其中，枯草芽孢杆菌，是一种革兰氏阳性杆状细菌，常见于土壤中。在土壤中营养物质不足或变少的情况下，枯草芽孢杆菌分泌胞外蛋白酶，从而降解土壤中的大分子蛋白质或肽来维持其生长和繁殖。
[0012]本专利技术的有益效果是：
[0013](1)本专利技术相较于其它机械裂解方法(例如水浴、超声、冻融)能更有效地裂解螺旋藻，将螺旋藻裂解为更短的肽和释放更多的游离氨基酸；
[0014](2)本专利技术的螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清制作的细菌培养基，与机械裂解方法(例如水浴、超声、冻融)获得裂解液的培养效果更佳；
[0015](3)本专利技术由于通过采用培养枯草芽孢杆菌获得的胞外分泌蛋白酶进行螺旋藻生物裂解，相比特定的商业酶更便宜，螺旋藻生物裂解对环境条件的要求低，只需要37℃左右进行即可，同时不受其它方法所需机器的限制，不涉及如超声和冻融所要求的重复处理，节约人工，更加的高效。
[0016]因此，本专利技术螺旋藻生物裂解的效率高，用于细菌培养效果佳，成本便宜，可推广到工业上进行大规模螺旋藻的裂解，用于细菌培养基的制作。
[0017]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0018]进一步，所述枯草芽孢杆菌培养的上清包含胞外分泌蛋白酶。
[0019]进一步，包括如下具体步骤：
[0020]S1：将OD600为0.5～1.5的枯草芽孢杆菌的种子液接种到NB培养液或LB培养液中，所述枯草芽孢杆菌的种子液与所述NB培养液或所述LB培养液的体积比(1～3)：(10～30)，在恒温振荡培养箱中以150～250转/分，32～42℃，培养60～84小时，直到培养所述枯草芽孢杆菌至平台期，离心，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；
[0021]S2：将螺旋藻干粉浸泡在双蒸水中，所述螺旋藻干粉与所述双蒸水重量比为(5～14)：(50～70)，得到所述螺旋藻的溶液；再将所述螺旋藻的溶液在温度至少为121℃高压蒸汽中灭菌至少15min，得到灭菌后的所述螺旋藻的溶液；然后在灭菌后的所述螺旋藻的溶液中加入所述枯草芽孢杆菌的培养上清，所述枯草芽孢杆菌的培养上清与所述双蒸水的体积比为(0.1～1)：(25～35)，置于恒温振荡培养箱中以150～250转/分，32～42℃，裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；
[0022]S3：检测所述螺旋藻的裂解液Ⅰ的pH，调节pH为6.7～7.3，在调节pH之后所述螺旋藻的裂解液Ⅰ中依次加入pH缓冲剂、与所述S2中等量的所述枯草芽孢杆菌的培养上清，置于恒温振荡培养箱中以170～230转/分，34～40℃，继续裂解4～6小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅱ；
[0023]S4：将所述螺旋藻的裂解液Ⅱ重复进行所述S3的调节pH，依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，及再次裂解3～7次，裂解结束后离心获取所述螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清，备用。
[0024]进一步，包括如下具体步骤：
[0025]S1：将OD600为0.7～1.3的枯草芽孢杆菌的种子液接种到NB培养液或LB培养液中，所述枯草芽孢杆菌的种子液与所述NB培养液或所述LB培养液的体积比(0.7～1.3)：(7～13)，在恒温振荡培养箱中以170～230转/分，34～40℃，培养66～78小时，直到培养所述枯草芽孢杆菌至平台期，离心，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；
[0026]S2：将螺旋藻干粉按浸泡在双蒸水中，所述螺旋藻干粉与所述双蒸水重量比为(5～12)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种螺旋藻生物裂解的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：培养枯草芽孢杆菌至平台期，离心至平台期的所述枯草芽孢杆菌，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；S2：将所述枯草芽孢杆菌的培养上清加入灭菌后的螺旋藻的溶液中，在32～42℃下裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；S3:检测所述螺旋藻的裂解液Ⅰ的pH，调节pH为6.5～7.5，在调节pH之后的所述螺旋藻的裂解液Ⅰ中依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，在32～42℃下再次裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅱ；S4:将所述螺旋藻的裂解液Ⅱ重复进行所述S3的调节pH，依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，及再次裂解3～7次，裂解结束后离心获取所述螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清，备用。2.根据权利要求1所述一种螺旋藻生物裂解的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌培养的上清包含胞外分泌蛋白酶。3.根据权利要求1所述一种螺旋藻生物裂解的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：S1：将OD600为0.5～1.5的枯草芽孢杆菌的种子液接种到NB培养液或LB培养液中，所述枯草芽孢杆菌的种子液与所述NB培养液或所述LB培养液的体积比(1～3)：(10～30)，在恒温振荡培养箱中以150～250转/分，32～42℃，培养60～84小时，直到培养所述枯草芽孢杆菌至平台期，离心，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；S2：将螺旋藻干粉浸泡在双蒸水中，所述螺旋藻干粉与所述双蒸水重量比为(5～14)：(50～70)，得到所述螺旋藻的溶液；再将所述螺旋藻的溶液在温度至少为121℃高压蒸汽中灭菌至少15min，得到灭菌后的所述螺旋藻的溶液；然后在灭菌后的所述螺旋藻的溶液中加入所述枯草芽孢杆菌的培养上清，所述枯草芽孢杆菌的培养上清与所述双蒸水的体积比为(0.1～1)：(25～35)，置于恒温振荡培养箱中以150～250转/分，32～42℃，裂解3～7小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；S3：检测所述螺旋藻的裂解液Ⅰ的pH，调节pH为6.7～7.3，在调节pH之后所述螺旋藻的裂解液Ⅰ中依次加入pH缓冲剂、与所述S2中等量的所述枯草芽孢杆菌的培养上清，置于恒温振荡培养箱中以170～230转/分，34～40℃，继续裂解4～6小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅱ；S4：将所述螺旋藻的裂解液Ⅱ重复进行所述S3的调节pH，依次加入pH缓冲剂、所述枯草芽孢杆菌的培养上清，及再次裂解3～7次，裂解结束后离心获取所述螺旋藻的裂解液Ⅱ的上清，备用。4.根据权利要求1所述一种螺旋藻生物裂解的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：S1：将OD600为0.7～1.3的枯草芽孢杆菌的种子液接种到NB培养液或LB培养液中，所述枯草芽孢杆菌的种子液与所述NB培养液或所述LB培养液的体积比(0.7～1.3)：(7～13)，在恒温振荡培养箱中以170～230转/分，34～40℃，培养66～78小时，直到培养所述枯草芽孢杆菌至平台期，离心，获得所述枯草芽孢杆菌的培养上清，冷藏备用；S2：将螺旋藻干粉按浸泡在双蒸水中，所述螺旋藻干粉与所述双蒸水重量比为(5～12)：(54～64)，得到所述螺旋藻的溶液；再将所述螺旋藻的溶液在温度至少为121℃高压蒸汽中灭菌至少15min，得到灭菌后的所述螺旋藻的溶液；然后在灭菌后的所述螺旋藻的溶液
中加入所述枯草芽孢杆菌的培养上清，所述枯草芽孢杆菌的培养上清与所述双蒸水的体积比为(0.1～1)：(27～32)，置于恒温振荡培养箱中以170～230转/分，34～40℃下，裂解4～6小时，得到所述螺旋藻的裂解液Ⅰ；S3：检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：周益装，李晓雯，黄宝霖，赵家伟，葛静怡，李焱钊，潘莹莹，卢海兰，陈美煐，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：