一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，且公开了一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，包括以下重量份数配比的原料：甘氨酸10~15份、氯化钠5~10份、精氨酸20~25份、D

【技术实现步骤摘要】
一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体为一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，可以应用于培养免疫细胞，例如淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞等，与有血清培养基相比，无血清培养基不含对细胞有害的动物成分，而且价格相对低。
[0003]然而，现有的无血清培养基培养免疫细胞时，为了加速细胞繁殖，缩短培养时间，在细胞培养前期需要补充自体血浆，否则很难达到临床的回输标准，而且所耗费的培养时间也更长，在三维培养体系中，该缺陷尤为显著，即使补充自体血浆，免疫细胞的增殖速度也比较慢，所需的培养时间远大于有血清培养基，因此，研发一种不用补充自体血浆即可适合免疫细胞快速增殖、有效缩短培养周期的免疫细胞培养基，是目前急需解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法，具备有效缩短细胞培养周期等优点，解决了细胞培养周期较长的问题。
[0005]（二）技术方案为实现上述有效缩短细胞培养周期的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于培养免疫细胞的培养基，包括以下重量份数配比的原料：甘氨酸10~15份、氯化钠5~10份、精氨酸20~25份、D
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泛酸钙2~4份、对氨基苯甲酸1~3份、无水磷酸二氢钠25~35份、还原谷胱甘肽3~5份、L
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胱氨酸二盐酸盐15~20份、L
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赖氨酸盐酸10~12份、L
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谷氨酰胺5~8份、氢离子缓冲剂3~6份、谷氨酰胺8~12份、庆大霉素6~9份，胰岛素12~14份、转铁蛋白15~20份、亚硒酸钠9~15份、生长因子5~15份和碳酸氢钠1500~2000mg/L。
[0006]优选的，所述氢离子缓冲剂为hepes化学缓冲剂，且其使用浓度为10~50mmol/L，所述胰岛素的使用浓度0.1~10μg
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mL。
[0007]优选的，所述转铁蛋白的使用浓度为0.5~100μg
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mL，亚硒酸钠的最适添加浓度是30~60nmol/L。
[0008]优选的，所述生长因子为表皮生长因子、神经生长因子、成纤维素细胞生长因子和卵泡刺激因子中的一种。
[0009]本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种用于培养免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：S1、（1）混合制备：将甘氨酸、氯化钠、精氨酸、D
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泛酸钙、对氨基苯甲酸、无水磷酸二氢钠和还原谷胱甘肽等原料通过专用的药匙挑取放置到承重设备上进行称取后，即可放入容器内进行加热混合，在加热混合过程中需边添加碳酸氢钠溶液边混合搅拌得混合物；
（2）调节除菌：将步骤S1中得到的混合物pH调节至6.2
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7.4，然后除菌，得到所述免疫细胞培养基；S2、培养：将外周血单个核细胞(PBMC)的分离(密度梯度离心法)将白膜用PBS液按1：1比例混合稀释，加入含有4mL淋巴细胞分离液的15mL试管中，用吸管取6mL稀释的细胞悬液，在分层液上1~3cm处，沿试管壁缓慢加入，移至离心机中，水平室温，离心后管内由上至下分为血浆、单个核细胞、淋巴细胞分离液、红细胞4个带；吸取单个核细胞层，移入另一试管中，二次离心，加3~4倍PBS，混匀，PBS洗细胞2次；以离心转速为800r／rain，离心5~8min，PBS洗细胞2次，将离心收集后外周血单个核细胞放于25~30cm培养瓶内，加入含25~35％培养基，置于37℃、以及含有5~7％CO浓度的孵箱内培养静置开设培养；S3、观察记录：细胞的形态观察倒置显微镜下每天观察培养中的细胞数目、形状、外观、生长状况等；S4、将培养后的细胞放置冷冻设备中冻存。
[0010]优选的，所述步骤S1中容器的大小应是所配置培养基总体积的2倍，所述步骤S1中加热温度为45~55℃，所述步骤S1中混合时间为15~30min。
[0011]优选的，所述步骤S2中首次离心转速为1800~2200r／rain，离心时间为18~24min，二次离心转速为800~1200r／rain，离心时间为8~12min。
[0012]（三）有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法，具备以下有益效果：1、该用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法，通过甘氨酸、氯化钠、精氨酸、D
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泛酸钙、对氨基苯甲酸、无水磷酸二氢钠和还原谷胱甘肽等原料所制备的细胞培养基与现有的无血清免疫细胞培养基相比，可无需补充血浆的情况下适合免疫细胞快速增殖，从而缩短了免疫细胞的培养周期，提高培养基的应用范围；2、该用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法，通过采用外周血单个核细胞以及淋巴细胞的离心处理，以及对试管内部的液体进行离心处理，一系列连续操作，节省了细胞分离时间，提高了离心效率，能够一次性进行大量免疫细胞的培养，提高培养效率。
具体实施方式
[0013]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
实施例一：
[0014]一种用于培养免疫细胞的培养基，包括以下重量份数配比的原料：甘氨酸10份、氯化钠5份、精氨酸20份、D
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泛酸钙2份、对氨基苯甲酸1份、无水磷酸二氢钠25份、还原谷胱甘肽3份、L
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胱氨酸二盐酸盐15份、L
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赖氨酸盐酸10份、L
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谷氨酰胺5份、氢离子缓冲剂3份、谷氨酰胺8份、庆大霉素6份，胰岛素12份、转铁蛋白15份、亚硒酸钠9份、生长因子5份和碳酸氢钠1500mg/L。
[0015]本实施例中，所述氢离子缓冲剂为hepes化学缓冲剂，且其使用浓度为10mmol/L，所述胰岛素的使用浓度0.1μg
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mL，所述转铁蛋白的使用浓度为0.5μg
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mL，亚硒酸钠的最适添加浓度是30nmol/L。
[0016]需要说明的是，所述生长因子为表皮生长因子、神经生长因子、成纤维素细胞生长因子和卵泡刺激因子中的一种。
[0017]一种用于培养免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：S1、（1）混合制备：将甘氨酸、氯化钠、精氨酸、D
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泛酸钙、对氨基苯甲酸、无水磷酸二氢钠和还原谷胱甘肽等原料通过专用的药匙挑取放置到承重设备上进行称取后，即可放入容器内进行加热混合，容器的大小应是所配置培养基总体积的2倍，在加热混合过程中需边添加碳酸氢钠溶液边混合搅拌得混合物，加热温度为45℃，混合时间为15min；（2）调节除菌：将步骤S1中得到的混合物pH调本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，包括以下重量份数配比的原料：甘氨酸10~15份、氯化钠5~10份、精氨酸20~25份、D
‑
泛酸钙2~4份、对氨基苯甲酸1~3份、无水磷酸二氢钠25~35份、还原谷胱甘肽3~5份、L
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胱氨酸二盐酸盐15~20份、L
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赖氨酸盐酸10~12份、L
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谷氨酰胺5~8份、氢离子缓冲剂3~6份、谷氨酰胺8~12份、庆大霉素6~9份，胰岛素12~14份、转铁蛋白15~20份、亚硒酸钠9~15份、生长因子5~15份和碳酸氢钠1500~2000mg/L。2.根据权利要求1所述的一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述氢离子缓冲剂为hepes化学缓冲剂，且其使用浓度为10~50mmol/L，所述胰岛素的使用浓度0.1~10μg
·
mL。3.根据权利要求1所述的一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述转铁蛋白的使用浓度为0.5~100μg
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mL，亚硒酸钠的最适添加浓度是30~60nmol/L。4.根据权利要求1所述的一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述生长因子为表皮生长因子、神经生长因子、成纤维素细胞生长因子和卵泡刺激因子中的一种。5.一种用于培养免疫细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、（1）混合制备：将甘氨酸、氯化钠、精氨酸、D
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泛酸钙、对氨基苯甲酸、无水磷酸二氢钠和还原谷胱甘肽等原料通过专用的药匙挑取放置到承重设备上进行称取后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振亚，
申请(专利权)人：昕慕江苏生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：