一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统技术方案

本发明专利技术提供了一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统。所述靶标集合在数据模拟中能够覆盖99%患者，对超过90%结直肠癌患者有4个以上突变，适用性广。采用所述靶标集合定制的探针形成固定化基因组合及试剂盒，以肿瘤不知情分析策略对不同结直肠癌样本的微小残留病灶状态进行监测，毋需对每个患者进行定制，容易标准化。同时靶标集合的区域精简，仅291 kb，在数万乘测序深度下，所需测序数据量较少，成本低。检测灵敏度高，能准确反映微小残留病状态，对患者的分子缓解状态进行持续跟踪，从而对根治性治疗的疗效进行评估，提前预测复发，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。术后临床管理具有重大意义。术后临床管理具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统。

技术介绍

[0002]微小残留病灶（Minimal residual disease，MRD）被认为是疾病复发的主要来源，目前临床常用的随访监测手段为血癌胚抗原和PET/CT等影像学手段，但往往不能灵敏地反映微小残留病灶，对于患者的复发监测效果灵敏度较低。因此，近年来出现了基于血浆中肿瘤游离核酸（Circulating tumor DNA，ctDNA）为微小残留病灶的复发监测手段。
[0003]对于基于血浆中肿瘤游离核酸ctDNA的MRD检测，主流的检测技术包括肿瘤知情分析（Tumor
‑
informed）和肿瘤不知情分析（Tumor
‑
agnostic）两种路线。肿瘤知情分析路线通常先进行组织全外显子WES检测，用配对血检测精准地排除非肿瘤来源的变异，然后针对组织检测结果定制个性化的基因组合（panel）进行超高深度测序进行肿瘤变异的监控；肿瘤不知情分析路线一般是对血液进行固定基因组合检测，仅凭血液检测获得最高的敏感性。其中肿瘤知情分析路线需要针对每个患者设计个性化的追踪基因组合，但难以解决肿瘤发生发展过程中的时空异质性问题，无法追踪新发突变，并且很难标准化，且成本较高。与之相对比的是，肿瘤不知情分析路线通常采用已经设计好的固定化基因组合来进行检测，可以获取更多变异信息，流程可标准化，同时可研究克隆演化。但固定化基因组合的难点在于靶标集合针对哪些位点，将直接影响到可追踪的患者比例，并且对检测技术灵敏度要求较高。
[0004]综上所述，提供一种能够将可追踪患者比例最大化的固定化基因组合用于结直肠癌样本的微小残留病灶MRD监测，同时控制基因组合大小，压缩测序量，降低患者的检测经济负担，并达到较高的灵敏度，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。
[0005]中国专利技术专利，公开号为CN113284554公开了一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤DNA检测系统及应用，但它需要获取患者原发肿瘤组织先进行425基因组合检测，再对患者血浆进行监测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统。所述靶标集合的筛选方法用于固定化基因组合检测MRD的策略，可用于超过99%的结直肠癌患者MRD检测，无须患者肿瘤组织，适用性广，且容易标准化。灵敏度高，单点突变检测灵敏度达0.05%，MRD检测灵敏度达0.005%，基因组合的数量小，仅291 kb，测序数据量要求较低，相应地，患者的经济负担较低。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方
法，所述筛选方法包括如下步骤：
[0009]（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合P0；
[0010]（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异；统计起始靶标集合P0区域发生变异的患者集合记为PT0；
[0011]（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；
[0012]（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合FG；计算集合FG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入起始靶标集合P0；补充后的靶标集合为P1，在上述区域发生变异的患者集合为PT1；
[0013]（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合LFG；计算集合LFG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入靶标集合P1；补充后的靶标集合为P2，在该区域发生变异的患者集合为PT2；
[0014]（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数MI；挑选MI≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合P2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合PT，若PT相对于PT2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为靶标集合P3，在所述靶标集合对应区域发生变异的患者集合为PT3；否则所述外显子不纳入靶标集合P2；
[0015]（7）对靶标集合P3进行精简，精简后相应的靶标集合则更新为靶标集合P4，在靶标集合P4对应区域发生变异的患者集合为PT4；
[0016]（8）对于靶标集合P4中的克隆性造血基因突变进行过滤；过滤后相应的靶标集合则更新为靶标集合P5，在靶标集合P5对应区域发生变异的患者集合为PT5。
[0017]本专利技术中，对于群体突变频率≥10%的基因，通过分析每个外显子的突变指数MI的分布，对于MI值较突出的外显子纳入靶标集合，对于MI值分布较平缓，即基因可能无突变热点，则将该基因所有外显子均纳入靶标集合。
[0018]本专利技术中，对于群体突变率<10%的基因，则挑选MI≥20的外显子纳入靶标集合。当MI筛选标准更低，例如筛选MI≥10的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更多，会使得基因靶标集合范围更大，增加检测成本。当筛选标准更高，例如筛选MI≥30的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更少，会使得基因靶标集合范围更小，虽然检测成本会一定程度上降低，但是所得靶标集合对有的肿瘤患者可能无法覆盖其所含的突变，即该靶标集合覆盖的肿瘤患者比例可能降低，影响最终的临床使用。
[0019]进一步地，以MI为标准，对潜在的驱动基因部分外显子也纳入靶标集合，进一步扩大靶标集合覆盖的患者比例。同时对于长度较长的外显子，通过细分120bp区段，将其进行更细致的分析，仅纳入能够扩大覆盖患者数目的区段，将靶标集合进行精简。
[0020]本专利技术中，在筛选靶标集合时，还剔除了克隆性造血基因突变、已及良性变异，进一步精简了靶标集合中与结直肠癌微小残留病灶无关的基因突变位点，使得所述靶标集合更合理，增加其应用时的准确度。
[0021]本专利技术所述筛选方法可适用于任意癌种的微小残留病灶靶标集合的筛选，在覆盖患者变异数目最大化的同时压缩靶标集合的区域范围，以达到节约成本的目的，同时不牺牲检测性能。
[0022]优选地，步骤（1）中，所述靶标集合包括下表（表1）所示区域。
[0023]表1
[0024][0025]。
[0026]优选地，步骤（2）中，所述公共数据库为COSMIC数据库和TCGA数据库。
[0027]公共数据库中信息分析两个维度：1）相应结直肠癌患者的基因变异情况，包括具体的基因、变异位点等信息；2）对特定基因变异集合，分析具有至少一个集合内的变异位点的患者数目及对应的比例。通过分析维度1的数据确定待考本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合P0；（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异；统计起始靶标集合P0区域发生变异的患者集合记为PT0；（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合FG；计算集合FG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入起始靶标集合P0；补充后的靶标集合为P1，在上述区域发生变异的患者集合为PT1；（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合LFG；计算集合LFG中基因的每个外显子的突变指数MI；根据MI值进行判断，将对应的外显子纳入靶标集合P1；补充后的靶标集合为P2，在该区域发生变异的患者集合为PT2；（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数MI；挑选MI≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合P2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合PT，若PT相对于PT2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为靶标集合P3，在靶标集合P3对应区域发生变异的患者集合为PT3；否则所述外显子不纳入靶标集合P2；（7）对靶标集合P3进行精简，精简后相应的靶标集合则更新为靶标集合P4，在靶标集合P4对应区域发生变异的患者集合为PT4；（8）对于靶标集合P4中的克隆性造血基因突变进行过滤；过滤后相应的靶标集合则更新为靶标集合P5，在靶标集合P5对应区域发生变异的患者集合为PT5。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，所述靶标集合包括下表所示区域；
。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述公共数据库为COSMIC数据库及TCGA数据库；步骤（2）中，所述良性变异或疑似良性变异对应的数据库为Clinvar数据库和COSMIC数据库；步骤（3）中，所述群体突变频率=在所述基因发生变异的患者样本数目/肿瘤患者样本总数；步骤（4）中，所述突变指数MI为每个外显子每1000 bp区域上发生变异的结直肠癌患者数量；步骤（4）中，所述根据MI值进行判断的标准为：（a）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值>2*平均值，则将该集合中>2*平均值的MI对应的外显子纳入起始靶标集合P0；（b）若所述基因外显子的突变指数MI值集合中最大值<2*平均值，则将该基因所有的外显子纳入靶标集合P0；步骤（5）中，所述根据MI值进行判断的标准为：筛选突变指数MI≥20的外显子，将所述外显子纳入靶标集合P1。4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（6）中，所述潜在驱动基因包括：ACVR2A、AMER1、ARAF、B2M、CTNNB1、HRAS、MAP2K1、MDM2、MDM4、MED12、MSH6、MYC、NCOA4、NOTCH1、NOTCH2、PMS2、POLE、PRDM2、PTEN、PTPN11、PTPRD、RNF43、SOX9、STAT3、TCF7L2、TGFBR2或ZNRF3中的一种或至少两种的组合；步骤（7）中，所述精简的标准包括：针对靶标集合P3中长度>2 kb的外显子，将所述外显子以120 bp为区段进行分割，将靶
标集合P3中每个120 bp区段进行去除后，分析PT3中患者数目是否减少；若减少，则所述120 bp保留；若未减少，则所述120 bp区段从靶标集合P3中去除；步骤（8）中，所述克隆性造血基因突变对应的基因包括：DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、SF3B1、CBL、CREBBP、TNR、TG、SPHKA、MUC5B、HERC2、DNAH8或ASTN1中的任意一种或至少两种的组合。5.一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合，其特征在于，所述靶标集合由权利要求1
‑
4中任一项所述的筛选方法筛选得到。6.根据权利要求5所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合，其特征在于，所述靶标集合包括177个基因中的426个外显子区段，所述靶标集合具体区域如下表所示；
。7.一种权利要求5或6所述的靶标集合对应的检测结直肠癌微小残留病灶的探针，其特征在于，所述探针的长度为11...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾凯丽，宋文惠，鲍远亮，王兆利，蒋泽宇，王方杰，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：