基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法技术

本发明专利技术公开了基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，S1：获取致病嗜水气单胞菌全基因组核苷酸编码序列；S2：利用在线软件预测外膜蛋白的粘附性、抗原性，筛选出超过指定阈值的蛋白，然后进行蛋白种间种内同源性比对，筛选出具有良好抗原性、粘附性、种间种内保守性高的外膜蛋白作为候选抗原；S3：进行外膜蛋白保守性验证，即采用PCR及测序检测主要外膜蛋白编码基因在不同基因型嗜水气单胞菌中的分布情况及其序列相似性。利用基因组数据通过生物信息学筛选和评估潜在嗜水气单胞菌外膜蛋白作为候选抗原；采用PCR及测序检测主要外膜蛋白编码基因在不同基因型嗜水气单胞菌中的分布情况及其序列保守性。气单胞菌中的分布情况及其序列保守性。气单胞菌中的分布情况及其序列保守性。

【技术实现步骤摘要】
基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法


[0001]本专利技术涉及医学领域，具体为基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法。

技术介绍

[0002]目前，嗜水气单胞菌疫苗的研究主要包括灭活疫苗、减毒疫苗和重组亚单位疫苗等。嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备具体为先从患病鱼提取致病嗜水气单胞菌菌种，复壮后选择最佳条件进行培养和灭活，经无菌检验和安全检验合格后制成疫苗。灭活疫苗虽然对特定毒株具有免疫保护作用，但对不同血清型的菌株，还不能达到较好的免疫交叉保护效果。且以全菌菌体作为抗原，成分复杂，易引起机体产生含有无关抗原的抗体，导致不良反应。
[0003]嗜水气单胞菌减毒疫苗，即通过改变培养条件，或在异种动物体内传代，使病原体毒性减弱，或利用基因工程技术去掉病原体基因组中毒力相关基因中的某一片段，使其成为缺损病原体来制备减毒疫苗。其缺点是病原菌可能会在水体中扩散和发生毒力回复现象。
[0004]由于传统疫苗的研制方法存在一些问题，如安全问题或部分病原体缺乏合适的培养条件等，导致了疫苗的重点研究方向转向了亚单位疫苗。亚单位疫苗是通过提取病原微生物的某些成分制成的疫苗，如细菌的外膜蛋白、脂多糖、类毒素、外毒素等。嗜水气单胞菌的外膜蛋白因具有良好的免疫原性以及交叉保护性，成为重组亚单位疫苗最具潜力的候选免疫抗原成分之一。传统筛选亚单位疫苗候选抗原的方法大多依靠经验筛选，需要基于对病原体的大量研究，根据前人经验选择可能的蛋白，经分离、纯化、鉴定和测试才能确定合适的抗原。耗费时间且通常仅能研究一两个抗原，效率低。现在多基于免疫蛋白质组学筛选疫苗抗原，即利用二维凝胶电泳、免疫印迹和质谱鉴定技术，这些方法费时费事且很少用于大规模探测免疫原性蛋白质，为此提供了基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，具体步骤如下：
[0007]S1：获取致病嗜水气单胞菌全基因组核苷酸编码序列，对目标嗜水气单胞菌J
‑
1菌株的基因组编码信息进行筛选和分析，先通过生物信息学分析算法找到病原体中能够编码成为潜在抗原的基因；即利用在线软件进行蛋白质的信号肽预测、跨膜螺旋结构预测和亚细胞定位筛选出外膜蛋白；
[0008]S2：利用在线软件预测外膜蛋白的粘附性、抗原性，筛选出超过指定阈值的蛋白，
然后进行蛋白种间种内同源性比对，筛选出具有良好抗原性、粘附性、种间种内保守性高的外膜蛋白作为候选抗原；
[0009]S3：进行外膜蛋白保守性验证，即采用PCR及测序检测主要外膜蛋白编码基因在不同基因型嗜水气单胞菌中的分布情况及其序列相似性。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S1中蛋白质的信号肽预测：使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在线网站对收集的核苷酸编码的蛋白质序列进行信号肽预测，只记录保留具有信号肽的蛋白。
[0011]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S1中跨膜螺旋结构预测：使用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/)预测蛋白质的信号肽中筛出的蛋白质跨膜螺旋结构；记录保留跨膜螺旋结构个数≤2的蛋白质，利用两个软件来预测蛋白质的跨膜螺旋，使结果更加准确，蛋白质中跨膜螺旋的数量越少，重组蛋白的表达和制备难度就越小。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S1中的亚细胞定位：使用PSORTb(https://www.psort.org/)、CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和Gneg
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mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Gneg
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multi/)预测跨膜螺旋结构中筛出的蛋白质的亚细胞定位，记录保留外膜蛋白。
[0013]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S2中利用在线软件预测外膜蛋白的粘附性、抗原性，其中抗原性的评估是采用VaxiJen软件对亚细胞定位筛选出的外膜蛋白的潜在抗原性进行评估，截止值设为0.4，记录保留抗原性≥0.4的蛋白质。
[0014]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S2中利用在线软件预测外膜蛋白的粘附性、抗原性，其中粘附性的评估是采用Vaxign在线软件，根据粘附指数在0.5以上的标准对外膜蛋白的粘附性进行预测。
[0015]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S2中蛋白种间种内同源性比对：将最终筛选出的蛋白质进行种间种内BLAST序列比对。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S3进行外膜蛋白保守性验证的具体步骤如下：
[0017]S31：根据筛选出的外膜蛋白序列，设计对应的引物，以不同基因型嗜水气单胞菌菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增并测序；
[0018]S32：分析测序结果，保留蛋白序列覆盖率超过80％的相似性数值，根据数值判断蛋白在流行的嗜水气单胞菌毒株与数据库中气单胞菌属的细菌上的保守性，数值越高，外膜蛋白的保守性越好。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S31中候选蛋白CDS区域的PCR扩增：根据候选蛋白CDS区序列设计特异性引物，以不同基因亚型嗜水气单胞菌基因组DNA为模板，对PCR反应体系和反应程序进行调整，以获得清晰的电泳条带，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行测序。
[0020]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述S32中分析测序结果是采用BLAST蛋白序列比对，利用DNAStar软件对测序菌株的全长序列进行分析并找到ORF，将参考菌株的39个候选蛋白序列与测序菌株和NR数据库中的同属细菌进行BLAST蛋白序列比对，保留并记录蛋白序列覆盖率大于80％的一致性数据。
[0021]致病性嗜水气单胞菌的鉴定：
[0022]16S rDNA基因特异性引物：16S rDNA F：5
′‑
AGAGTTTGATCATGGCTCAG
‑3′
；16S rDNA R：5
′‑
GGTTACCTTGTTACGACTT
‑3′
。
[0023]以实验室收集的10株疑似嗜水气单胞菌菌株的细菌基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA基因的保守区域，然后测序。最后，利用DNAStar软件(http://www.dnastar.com)等软件组装全长序列，并通过BLAST进行序列比对。16S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因,长度约为1500bp，由10个保守区和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，其特征在于：具体步骤如下：S1：获取致病嗜水气单胞菌全基因组核苷酸编码序列，对目标嗜水气单胞菌J
‑
1菌株的基因组编码信息进行筛选和分析，先通过生物信息学分析算法找到病原体中能够编码成为潜在抗原的基因；即利用在线软件进行蛋白质的信号肽预测、跨膜螺旋结构预测和亚细胞定位筛选出外膜蛋白；S2：利用在线软件预测外膜蛋白的粘附性、抗原性，筛选出超过指定阈值的蛋白，然后进行蛋白种间种内同源性比对，筛选出具有良好抗原性、粘附性、种间种内保守性高的外膜蛋白作为候选抗原；S3：进行外膜蛋白保守性验证，即采用PCR及测序检测主要外膜蛋白编码基因在不同基因型嗜水气单胞菌中的分布情况及其序列相似性。2.根据权利要求1所述的基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，其特征在于：所述S1中蛋白质的信号肽预测：使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在线网站对收集的核苷酸编码的蛋白质序列进行信号肽预测，只记录保留具有信号肽的蛋白。3.根据权利要求1所述的基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，其特征在于：所述S1中跨膜螺旋结构预测：使用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/)预测蛋白质的信号肽中筛出的蛋白质跨膜螺旋结构；记录保留跨膜螺旋结构个数≤2的蛋白质，利用两个软件来预测蛋白质的跨膜螺旋，使结果更加准确，蛋白质中跨膜螺旋的数量越少，重组蛋白的表达和制备难度就越小。4.根据权利要求1所述的基于反向疫苗学技术筛选嗜水气单胞菌保护性抗原的方法，其特征在于：所述S1中的亚细胞定位：使用PSORTb(https://www.psort.org/)、CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和Gneg
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mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Gneg
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multi/)预测...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁祝进，张婷，张敏颖，徐泽华，赵晓恒，程汉良，许建和，陈香凝，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：