用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞及制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞，同时还提供了其制备工艺，通过修饰和加载制备了rt

【技术实现步骤摘要】
用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞及制备方法


[0001]本专利技术公开一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞，同时还提供了其制备工艺，属于生物医药生产


技术介绍

[0002]脑卒中俗称中风，包括缺血性脑卒中（脑梗死）和出血性脑卒中（脑实质出血、脑室出血、蛛网膜下腔出血），对于急性脑卒中患者，应在治疗窗内采用溶栓类药物进行溶栓治疗。
[0003]阿替普酶，一种重组组织型纤溶酶原激活剂（Recombinant Tissue plasminogen Activator，rt
‑
PA），作为一线治疗药物应用于症状发作3 h内的患者。研究表明，炎性反应过程是缺血性脑卒中发生的主要原因，炎症部位pH降低呈酸性环境。缺血性脑卒中可诱导NF
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kB的活化，从而介导外周血的急性炎症反应，脑卒中后外周血中TNF
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α、IL
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6、IL
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lβ等细胞因子和趋化因子的表达水平明显上升。脑卒中后抑制NF
‑
kB的活性能降低脑损伤，P65
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siRNA能够通过调控NF
‑
kB通路抑制其表达，从而降低炎症反应。siRNA是一种小干扰RNA，分子属于双链，长度为20
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24个碱基对，终止于具有磷酸化 5' 和羟基化 3' 末端的两个核苷酸，通过RNA干扰所引起的基因沉默进行调控基因表达。由于siRNA和rt
‑
PA具有稳定性差、递送效率低以及不能靶向特定组织等缺点，因此体内递送的相关研究面临了许多技术挑战。
[0004]介孔二氧化硅（MSN）作为一种良好的药物递送载体，具有可连续调节的均一介孔孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面和无生理毒性等特点。通过静电相互作用将siRNA和rt
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PA包载于带有正电的MSN
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Py可以减少非靶向部位的释放。同时，在包载药物的过程中加入阀门，能够使其在炎症部位所在的低pH酸性环境中精准释放，而在细胞中保持稳定，使其具有pH响应特性。在药物包载过程中，常规的载药方式如孵育，无法精准控制载药量，而通过细胞纳米电穿孔技术加载药物则能够精准控制载药量，提高载药效率，实现无创、精准给药。
[0005]炎症反应发生时，免疫细胞会从血液中募集，并定向趋化至炎症反应部位。中性粒细胞（Neutrophils）占血液白细胞总数的60
‑
70%，是白细胞中数量最多的一种。中性粒细胞来源于骨髓，产生速率高，每分钟约1
×
107个，但存活期短，约为2
‑
3天。中性粒细胞具有很强的趋化作用和吞噬功能，当病原体在局部引发感染时，它们可迅速穿越血管内皮细胞进入感染部位，对侵入的病原体发挥吞噬杀伤和清除作用。中性粒细胞表面具有IgG Fc受体，也可通过调理作用促进和增强其吞噬杀菌作用。在脑卒中过程中，中性粒细胞作为一线响应细胞，可以迅速的被血液里的细胞炎症因子如TNF
‑
α激活，在5分钟内跨过血脑屏障，达到脑卒中部位。当载有治疗性药物的功能化中性粒细胞到达炎症部位后，通过抑制NF
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kB的通路降低卒中部位相关炎症因子如TNF
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ɑ
、IL
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1β、IL
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6等，能够降低炎症部位中性粒细胞的浸润并抑制血液循环里中性粒细胞的后续募集。近年来，有相关研究将中性粒细胞作为细胞类药物递送系统，用于递送药物至肿瘤相关部位。但中性粒细胞作为药物递送系统，在缺血
性脑卒中领域的相关研究尚且空白。

技术实现思路

[0006]本专利技术构建了一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞，构建了一种具有pH响应特性、溶血栓、降炎症反应、同时能迅速抵达脑卒中的炎症部位进行释药的中性粒细胞载药系统，能够对缺血性脑卒中有良好的治疗作用。利用功能化修饰的中性粒细胞作为载药系统，将药物靶向递送至卒中部位。本专利技术为达到本专利技术目的，采用的技术方案如下：将MSN进行化学修饰使之呈正电性后，将rt
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PA、P65
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siRNA和pH响应阀门与其共同加载进行载药，进行离心洗涤纯化后，得到rt
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PA
‑
siR
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MSN，通过细胞纳米穿孔技术将rt
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PA
‑
siR
‑
MSN负载到中性粒细胞中去，得到的功能化修饰的中性粒细胞即用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞。
[0007]本专利技术所述的一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞，具有明显分叶核，具有表面标志物Ly
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6G/Ly
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6C及MAIR
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IV，且包载rt
‑
PA
‑
siR
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MSN。本专利技术制得的功能化中性粒细胞具有pH响应特性，能够在炎症部位精准释放药物；可以抑制NF
‑
kB通路的表达，降低卒中部位炎症反应；递送rt
‑
PA，能够有效溶解血栓，实现对缺血性脑卒中的快速响应、精准递送、高效治疗。
[0008]本专利技术所述的一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞的制备方法，包括如下步骤：1）将MSN与（3
‑
氯丙基）三甲氧基硅烷于甲苯中以质量比1~2：2~6：80~180的比例在N2保护下120℃反应24 h后，离心除去上清液，将产物MSN
‑
Cl与吡啶以质量比1~3：8~20的比例在120℃反应24 h，即得到带有正电性的MSN
‑
Py，减压干燥后待用；2）将步骤1）中的MSN
‑
Py与rt
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PA、P65
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siRNA和柱[5]芳烃（阀门）在4℃的条件下过夜加载，得到载药后的rt
‑
PA
‑
siR
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MSN；3）从大鼠外周血中提取中性粒细胞，计数稀释后采用细胞纳米穿孔技术，将rt
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PA
‑
siR
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MSN导入中性粒细胞中，获得用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞。
[0009]本专利技术步骤3）中性粒细胞的药物负载采用细胞纳米穿孔技术，其中，细胞纳米穿孔技术装载药物的过程为：将提取的中性粒细胞以5
×
105个/mL 1 mL附着于纳米通道阵列的芯片表面上，将制备好的rt
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PA
‑
siR
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MSN加入缓冲液通道，在200
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220 V的瞬间脉冲下，将rt
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PA
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siR
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MSN负载于中性粒细胞中，得到功能化修饰的中性粒细胞。
[0010]本专利技术的积极本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞，其特征在于：中性粒细胞具有明显分叶核，具有表面标志物Ly
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6G/Ly
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6C及MAIR
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IV，且包载rt
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PA
‑
siR
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MSN；能够在炎症部位实现pH响应性精准释放药物，减少非靶向部位的释放；可以抑制NF
‑
kB通路的表达，降低卒中部位炎症反应，减少中性粒细胞募集；递送rt
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PA，能够有效溶解血栓，实现对缺血性脑卒中的快速响应、精准递送、高效治疗。2.如权利要求1所述的一种用于缺血性脑卒中治疗的功能化中性粒细胞的制备方法，包括如下步骤：1）将MSN与（3
‑
氯丙基）三甲氧基硅烷于甲苯中以质量比1~2：2~6：80~180的比例在N2保护下120℃反应24 h后，离心除去上清液，将产物MSN
‑
Cl与吡啶以质量比1~3：8~20的比例在120℃反应24 h，即得到带有正电性的MSN
‑
Py，减压干燥后待用；2）将步骤1）中的MSN
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Py与rt
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨照罡，刘洛桐，张欢，滕乐生，崔雅欣，陈嘉怡，史佳楠，孙漫，胡斯源，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：