一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法技术

一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法，属于流感病毒培养技术领域。为解决细胞源禽流感病毒生产过程中存在细胞密度过大，进而导致抗原纯化及浓缩困难的问题，提供了一种利用PK

【技术实现步骤摘要】
一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法


[0001]本专利技术属于流感病毒培养
，具体涉及一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法。

技术介绍

[0002]禽流感是由禽流感病毒引发的能够感染禽及人的烈性呼吸道传染病，该病致死率高，传播迅速，每年都会对全球的养禽业造成巨大影响。该病尚无有效的治疗手段，涉疫地区常以范围扑杀为主，疫苗免疫是目前预防禽流感的主要方式。现阶段禽流感疫苗的病毒培养方式主要以鸡胚培养和细胞培养为主，胚源病毒免疫原性较好但生产成本高、生产效率低、工作强度大、均一性差且有外源污染的可能，该方式正逐步被细胞培养所替代。目前细胞源禽流感病毒培养大多以MDCK或Vero细胞为主，利用生物反应器对细胞进行无血清全悬浮培养，该生产方式获得的禽流感病毒往往具有较高的抗原滴度且在生产过程中具有自动化程度高、易放大、成本低、批间稳定性好以及避免了外源病毒干扰等优点。但在实际生产过程中，为了获得较高的病毒滴度往往追求较高的细胞密度，细胞碎片及杂蛋白的浓度也随之增加，这不利于下游的抗原纯化及浓缩。

技术实现思路

[0003]本专利技术为解决细胞源禽流感病毒生产过程中存在细胞密度过大，进而导致抗原纯化及浓缩困难的问题，提供了一种利用PK
‑
15细胞规模化培养禽流感病毒的方法，该方法操作简单，极大降低了病毒培养过程中的细胞密度，为规模化生产细胞源禽流感病毒提供了新方法。本专利技术的具体技术方案如下：
[0004]本专利技术提供了一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
[0005](1)利用无血清全悬浮培养基驯化PK
‑
15细胞；
[0006](2)全悬浮PK
‑
15细胞生物反应器放大培养；
[0007](3)利用全悬浮PK
‑
15细胞培养禽流感病毒。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)的具体方法为：
[0009]S1、用EDTA
‑
胰酶溶液对PK
‑
15单层贴壁细胞进行消化，用无血清全悬浮培养基吹散消化好的PK
‑
15细胞；
[0010]S2、离心，弃去上清，获得细胞沉淀；
[0011]S3、用无血清全悬浮培养基重悬S2获得的细胞沉淀并转入摇瓶，获得细胞密度为0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml的细胞悬液；
[0012]S4、向S3的细胞悬液中加入终浓度为2μg/ml的胰酶，将摇瓶置于37℃，含5％二氧化碳的摇床中，140rpm，培养72h，获得细胞悬液；
[0013]S5、连续重复培养10
‑
15代，获得全悬浮PK
‑
15细胞悬液；所述重复培养过程为对每代培养获得的细胞悬液进行离心，弃去上清获得细胞沉淀，加入无血清全悬浮培养基重悬
细胞沉淀，并将细胞密度调节至0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，再补加终浓度2μg/ml的胰酶，重复培养的条件同S4，随着传代次数的增加，逐渐降低胰酶的添加量直至不添加。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，S1所述EDTA
‑
胰酶溶液的溶质为胰酶，溶剂为含有EDTA的Hank
’
s溶液，溶质与溶剂的料液比为0.25g：100ml，EDTA在Hank
’
s溶液中的质量分数为0.02％。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，S1所述EDTA
‑
胰酶溶液中胰酶的活力单位为250U/g。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，S2所述离心的条件为270g/min，室温离心5min。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)的具体方法为：
[0018]A.取步骤(1)获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液200ml，导入已灭菌、校准、保压的1.5L生物反应器中，补加无血清全悬浮培养基0.8L，细胞初始密度0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，培养72h；
[0019]B.取A中获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液1L，导入已灭菌、校准、保压的10L生物反应器中，补加无血清全悬浮培养基4L，细胞初始密度0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，培养72h；
[0020]C.取B中获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液5L，导入已灭菌、校准、保压的30L生物反应器中，补加无血清全悬浮培养基20L，细胞初始密度0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，培养72h，获得全悬浮PK
‑
15细胞悬液。
[0021]以上为全悬浮PK
‑
15细胞由摇瓶放大至30L生物反应器的培养方法，该方法也适用于更大培养体系的生物反应器培养。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，步骤A、步骤B和步骤C所述的培养条件为37℃，110rpm
‑
140rpm，溶氧50％，pH7.0。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，步骤A所述的1.5L生物反应器培养参数为37℃，140rpm，溶氧50％，pH7.0。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，步骤B所述的10L生物反应器培养参数为37℃，120rpm，溶氧50％，pH7.0。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，步骤C所述的30L生物反应器培养参数为37℃，110rpm，溶氧50％，pH7.0。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)的具体方法为
[0027]a.将步骤(2)获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液导出10L至已灭菌、校准、保压的120L生物反应器中，再向生物反应器中补加无血清全悬浮培养基40L，细胞初始密度0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，培养72h；
[0028]b.当细胞密度生长至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种规模化培养细胞源禽流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用无血清全悬浮培养基驯化PK
‑
15细胞；(2)全悬浮PK
‑
15细胞生物反应器放大培养；(3)利用全悬浮PK
‑
15细胞培养禽流感病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：S1、用EDTA
‑
胰酶溶液对PK
‑
15单层贴壁细胞进行消化，用无血清全悬浮培养基吹散消化好的PK
‑
15细胞；S2、离心，弃去上清，获得细胞沉淀；S3、用无血清全悬浮培养基重悬S2获得的细胞沉淀并转入摇瓶，获得细胞密度为0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml的细胞悬液；S4、向S3的细胞悬液中加入终浓度为2μg/ml的胰酶，将摇瓶置于37℃，含5％二氧化碳的摇床中，140rpm，培养72h，获得细胞悬液；S5、连续重复培养10
‑
15代，获得全悬浮PK
‑
15细胞悬液；所述重复培养过程为对每代培养获得的细胞悬液进行离心，弃去上清获得细胞沉淀，加入无血清全悬浮培养基重悬细胞沉淀，并将细胞密度调节至0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，再补加终浓度2μg/ml的胰酶，重复培养的条件同S4，随着传代次数的增加，逐渐降低胰酶的添加量直至不添加。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：A.取步骤(1)获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液200ml，导入已灭菌、校准、保压的1.5L生物反应器中，补加无血清全悬浮培养基0.8L，细胞初始密度0.8
×
106cells/ml
‑
1.0
×
106cells/ml，培养72h；B.取A中获得的密度为4.0
×
106cells/ml
‑5×
106cells/ml的全悬浮PK
‑
15细胞悬液1L，导入已灭菌、校准、保压的10L生物反应器中，补加无血清全悬浮培养基4L，细...

【专利技术属性】
技术研发人员：高宏雷，张峣，付海兵，王晓龙，鞠妍，王青竹，于德斌，张莎，张义爽，庞宁，李婉莹，刘景利，蔡雪辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：