一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体HZ2201，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa phage)，于2023年04月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No：M 2023598，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。本发明专利技术噬菌体HZ2201是筛选出的新的菌株，对铜绿假单胞菌生物被膜的形成具有较高的抑制能力，可以有效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，且具有宿主谱广、稳定性高、安全性高等优势，对治疗耐药铜绿假单胞菌相关感染具有良好的应用前景，社会和经济效益巨大。济效益巨大。济效益巨大。
【技术实现步骤摘要】
一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体及应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体及应用。
技术介绍
[0002]铜绿假单胞菌(Pseudomon asaeruginosa，PA)是一种引起医院严重院内获得性感染的重要的条件致病菌，常见于正常人体的皮肤、肠道和呼吸道，其感染多见于烧伤、创伤或手术切口等皮肤黏膜受损部位，可引起免疫功能低下患者的各种急性及慢性感染等。当前由于抗生素滥用而引起的细菌耐药性问题在逐年增长，临床上耐药和铜绿假单胞菌分离率不断增加，随着亚胺培南美罗培南等碳青霉烯类在临床PA感染治疗中的滥用，临床上耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(CRPA)分离率逐年攀升。全国细菌耐药监测网统计显示铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的全国平均耐药达到了18.3％，给临床耐药菌感染性疾病治疗带来了极大的挑战，临床迫切需要寻找和开发新型有效的CRPA抗菌制剂。
[0003]噬菌体为一类裂解杀菌的病毒，外层的蛋白质外壳和内层的核酸遗传物质组成，无完整细胞结构，个体十分微小。噬菌体在自然界种类多、数量巨大且分布广泛，具有严格的宿主特异性，可感染并杀灭细菌，通常对人和动物无害，可作为一种生物抗菌剂来治疗耐药菌引起的感染。噬菌体衣壳形态多样，而噬菌体核酸为DNA(单链或双链)或RNA。超过95％的噬菌体属于尾病毒目，根据尾部形态可进一步分为3个主要类群：肌尾病毒科、长尾病毒科和短尾病毒科。短尾病毒科仅占有尾病毒科数量的14％。噬菌体根据能否裂解宿主菌而被分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体，裂解性噬菌体菌体感染宿主菌主要通过几个步骤：吸附、核酸分离并进入宿主菌、核酸进行表达与复制、子代病毒颗粒的组装、释放和传播。通常使用裂解性噬菌体应用于抗菌治疗。研究显示某些裂解性噬菌体能够有效裂解杀灭耐药铜绿假单胞菌株，动物实验和临床研究广泛证实噬菌体治疗铜绿假单胞菌感染的有效性。但噬菌体也因特异性高引起的抗菌谱过窄的问题是影响噬菌体治疗的最重要障碍之一。故有效耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的广谱裂解性噬菌体的分离对临床耐药PA感染治疗有重要意义。
技术实现思路
[0004]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体及应用，可有效解决临床耐药PA感染治疗的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决的技术方案是，一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体HZ2201，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa phage)，于2023年04月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M 2023598，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
[0006]所述的噬菌体HZ2201在制备用于裂解耐多药铜绿假单胞菌制剂中的应用。
[0007]所述的噬菌体HZ2201在制备用于防治由耐多药和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌引起
的疾病的药物中的应用。
[0008]本专利技术噬菌体HZ2201是筛选出的新的菌株，对铜绿假单胞菌生物被膜的形成具有较高的抑制能力，可以有效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，且具有宿主谱广、稳定性高、安全性高等优势，对治疗耐药铜绿假单胞菌相关感染具有良好的应用前景，社会和经济效益巨大。
附图说明
[0009]图1是本专利技术噬菌体HZ2201的形态特征图；其中，(A)：噬菌体在双层琼脂平板中的噬斑形态。(B)：透射电镜下噬菌体形态。
[0010]图2是本专利技术噬菌体HZ2201的生物学特性图；其中，(A)：不同MOI(0.001～10)噬菌体滴度确定最佳感染复数(MOI)；(B)：噬菌体HZ2201在MOI为0.01时的一步生长曲线；(C)：不同温度(20、30、40、50、60、70)孵育1h后噬菌体滴度；(D)：噬菌体在不同pH(3、5、7、9、11、13)孵育1h后滴度。数据以均数
±
标准差(n＝3)表示。
[0011]图3是本专利技术噬菌体HZ2201对PAO1和PA143生物膜形成的影响柱状图；其中，(A)和(B)：噬菌体分别在PAO1和PA143形成的不同阶段对生物膜数量的影响；(C)：噬菌体分别在PAO1和PA143形成的不同阶段对生物膜内细菌活性的影响。
[0012]图4是本专利技术噬菌体HZ2201基因组的CGview图谱。
具体实施方式
[0013]以下结合附图和具体情况对本专利技术的具体实施方式作详细说明。
[0014]本专利技术铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa phage)噬菌体HZ2201是从中国郑州市东风渠，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa phage)，于2023年04月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：M 2023598，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
[0015]本专利技术能够有效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
[0016]一、铜绿假单胞菌噬菌体的分离和纯化
[0017]河水样本采集于中国郑州市东风渠，宿主菌为PAO1。水样静置后，过滤杂质，5000
×
g离心10分钟，使用0.22μm滤膜过滤除菌。将滤液与2
×
LB液体培养基等比例混合，再加入1％的宿主菌，37℃振荡培养至澄清。5000
×
g离心10min后过滤除菌，得到噬菌体裂解液。使用双层琼脂平板法纯化噬菌体，37℃过夜培养后从平板中挑取单个噬菌体菌斑于LB液体培养基中，加入宿主菌，37℃振荡培养至澄清后，重复使用双层琼脂平板法，至平板上的菌斑大小、形态一致，即可得到纯化的噬菌体。
[0018]上述分离纯化制备出的噬菌体HZ2201的菌体形态如图1A所示，该噬菌体菌斑大小一致，菌斑清晰，边缘整齐，透光性好，直径约1mm，菌斑呈现出裂解性噬菌体特征。
[0019]二、透射电镜观察噬菌体形态
[0020]将含有噬菌体斑块的双层琼脂板用SM缓冲液(上海生物技术生物有限公司，中国)浸泡，放置4h，然后离心过滤，去除细菌沉淀物。然后用15ml 100kD超滤管(Millipore，美国)3000
×
g离心20min，浓缩噬菌体，然后取10μL浓缩液，滴入200目铜网中，让其自然干燥，
并加入2％磷钨酸，静置2min，吸出多余液体，让其自然干燥，然后用透射电子显微镜(JEM1400，JAPAN Electron OPTICS LABORATORY CO.,LTD)观察。
[0021]结果如图1B所示，透射电镜下的噬菌体头部为二十面体结构，直径约为72.32nm，尾部为不收缩的短尾，长度约为14.63nm(图1B)。根据形态学，该噬菌体被判断为短尾病毒科。三、噬菌体HZ2201的生物学特性
[0022](1)最佳感染复数
[0023]噬菌体的感本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体HZ2201，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa phage)，于2023年04月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No：M 20...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱芮，费冰，李永伟，刘心伟，
申请(专利权)人：河南省中医院河南中医药大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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