用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株制造技术

本发明专利技术公开一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株，是鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV

【技术实现步骤摘要】
用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株


[0001]本专利技术属于疫苗制备
，尤其是一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株。

技术介绍

[0002]疫苗免疫是水生动物病毒病防治最有效的手段，已有灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和弱毒活疫苗等，免疫方式有注射免疫和浸泡免疫，其中浸泡免疫因操作简单、效率高、成本低且对水生动物损害小等被认为是最具有实用性的免疫方式。由于浸泡免疫对毒株量的需求远远高于注射免疫，故现有活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等均只能采用注射免疫接种的方式，只有部分弱毒活疫苗可采用浸泡免疫，这也是弱毒活疫苗的优势之一。但是，弱毒活疫苗的缺点是弱毒株的毒力易返强，故体内传代后毒力不返强且对细胞系敏感（产生较高毒株量）的弱毒株是制备弱毒活疫苗且实现浸泡免疫的必要条件。
[0003]鲫鱼是我国淡水养殖的常见鱼种，约占淡水鱼总养殖产量的12%。鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinid herpesvirus 2, CyHV
‑
2）感染鲫鱼而引起的鲫造血器官坏死病，其传染性强，致死率高达90
‑
100%，针对鲫造血器官坏死病，目前已有相关疫苗研究。中国专利申请号为202010183827.6的专利技术专利申请，公开了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株及其应用，所述鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株是分离自白鲢的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株CyHV
‑
2DX2019，作为鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒疫苗的应用。然而，该专利申请说明书（0018
‑
0027）记载，CyHV
‑
2 DX2019接种鲫脑组织细胞（GiCB）连续盲传10代培养，在该感染过程中细胞不出现典型的病变效应，仅对盲传第10代接毒细胞的培养物进行病毒DNA扩增，证明盲传第10代接毒细胞中含有鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株CyHV
‑
2 DX2019，采用PCR技术确定病毒浓度≥5
×
105copies/ml。说明鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株CyHV
‑
2 DX2019对鲫脑组织细胞（GiCB）系不敏感，很难做到大规模培养毒株。因此，以鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株CyHV
‑
2DX2019制备的疫苗只能通过腹腔注射免疫方式刺激鱼体产生免疫应答，且最小剂量注射免疫保护率只能达到92.85%。

技术实现思路

[0004]本专利技术是为了解决现有技术所存在的问题，提供一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株。所述鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株（Cyprinid herpesvirus2, CyHV
‑
2），已于2022年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号；保藏编号：CGMCC NO: 24099。
[0005]本专利技术的技术解决方案是一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株，是鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2, CyHV
‑
2）G
‑
RP7，保藏编号是CGMCC No.24099。
[0006]本专利技术提供的鲤疱疹病毒Ⅱ型G
‑
RP7是分离自金鱼的鲤疱疹病毒II型弱毒株，以该弱毒株感染金鱼鳍条细胞系（RyuF
‑
2），4
‑
5天后观察细胞出现典型的细胞病变效应（CPE）且连续传代均能稳定引起细胞病变，对RyuF
‑
2细胞系敏感，实现弱毒株体外稳定培养与扩
增，Reed
‑
Muench法测定病毒悬液的TCID
50
可达10
5.9
/ml，同时该弱毒株经体外和体内连续传代后不出现毒力返强。可用于制备鲫造血器官坏死病疫苗，浸泡免疫和腹腔注射免疫均可刺激鱼体产生特异性免疫应答，具有良好抗鲤疱疹病毒II型感染的效果，其中注射免疫保护率高达100%，明显高于现有技术注射免疫保护率；浸泡免疫在最小免疫量研究中发现，当病毒悬液TCID
50
为2
×
102/ml时，免疫保护率可达94%，在免疫途径优于注射免疫情况下，免疫保护率也高于现有技术注射免疫保护率。
附图说明
[0007]图1是本专利技术实施例光学显微镜下的正常RyuF
‑
2细胞和接种G
‑
RP7后出现细胞病变图。
[0008]图2是本专利技术实施例不同免疫浓度下对异育银鲫的保护率示意图。
[0009]图3是本专利技术实施例G
‑
RP7浸泡免疫21天后病毒抗体水平（ELISA）示意图。
[0010]图4是本专利技术实施例G
‑
RP7注射免疫21天后病毒抗体水平（ELISA）示意图。
[0011]保藏日期：2022年1月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；地址：北京市朝阳区大屯路甲3号；保藏编号：CGMCC NO: 24099。
具体实施方式
[0012]1. 鲤疱疹病毒II型G
‑
RP7株的分离鉴定和培养（1）鲤疱疹病毒II型G
‑
RP7株的分离鉴定本专利技术中的鲤疱疹病毒II型G
‑
RP7株来源于患病的金鱼。取患病濒死金鱼肾脏组织经含有1%青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液的M199培养基清洗后，进行匀浆，匀浆液12,000 rpm/min离心10 min，取上清经0.22 μm滤膜除菌后，接种于鎏金金鱼的鳍条细胞RyuF
‑
2中，25℃条件下，培养于添加5%胎牛血清和1%三抗（青霉素、链霉素和庆大霉素）M199培养基中。持续观察细胞病变，于10天后收集细胞培养上清（细胞培养物），储存于
‑
80
o
C。该细胞培养物用引物CyHV
‑
2Hel
‑
F：5
’‑
GGGGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC
‑3’
和CyHV
‑
2Hel
‑
R：5
’‑
CCATAGTCACCATCGTCTCATC
‑3’
进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示约为360bp，与鲤疱疹病毒II型阳性目的片段条带大小一致，序列比对结果表明其为CyHV
‑
2序列。
[0013]（2）鲤疱疹病毒II型G
‑
RP7株的培养将保存于
‑
80
o
C的细胞培养物，室温融化后取100 μl，接种于长有单层RyuF
‑
2细胞的25cm3细胞培养瓶中，于血清浓度为5%的M199培养基中培养，光学显微镜下每日观察细胞病变效应，结果如图1A、B所示，图1A是正常的RyuF<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株，其特征是鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus2, C...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏畅，李强，乔帼，孙雨雨，徐超楠，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：