一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法技术

一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法，包括以下步骤：取粪便样本置于离心管中，加入4mL的粪便蛋白裂解液震荡30s，冰上静置后再次震荡30s，静置20min后离心并将上清液并转移到另一离心管继续离心，再吸取上清液得到粪便蛋白裂解液；将定量好的粪便蛋白加入蛋白上样缓冲液，在100℃下煮沸10min后置于冰上放置10min；按照40μg的蛋白上样量经SDS

【技术实现步骤摘要】
一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法


[0001]本专利技术涉及一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法。

技术介绍

[0002]粪便含有丰富消化道的分泌物和脱落细胞，其能很好地反映胃肠道、胰腺和肝胆相关脏器的功能状态。因临床检验中提取办法的限制，粪便中很多有用信息常被忽视，如脱落细胞中肿瘤标志物、细菌代谢产物、人体代谢产物等。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法，该方法通过提取粪便中的蛋白质并对其进行电泳分析，用以反应反映胃肠道、胰腺和肝胆相关脏器的功能状态。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种人类粪便蛋白的提取方法，包括以下步骤：
[0005](1)取新鲜的粪便样本，置于电子天平中称取1g于15mL第一离心管中；
[0006](2)向第一离心管中加入4mL的粪便蛋白裂解液，所述的粪便蛋白裂解液的制备方法为：取80mL的去离子水，依次加入0.9g的NaCl、20mmol的Tris
‑
HCl、1mL的Triton X
‑
100、200μg的抑肽酶和20μg的斑蝥素，加入NaOH调节pH值为7.5，加入适量的去离子水定容为100mL；
[0007](3)然后用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置5min，再次用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置20min；
[0008](4)将第一离心管在2500rpm下离心5min，吸取上清液并转移到1.5mL的第二离心管；r/>[0009](5)将第二离心管在12000rpm下离心10min，吸取上清液并转移到1.5mL的第三离心管，第三转移至第三离心管的上清液即为粪便蛋白裂解液；
[0010](6)将粪便蛋白裂解液经BCA法定量粪便样本中总蛋白质的浓度；
[0011](7)将定量好的粪便蛋白置于
‑
80℃冰箱保存备用。
[0012]根据上述人类粪便蛋白的提取方法提取的粪便蛋白进行SDS
‑
PAGE电泳分析的方法，包括以下步骤：
[0013](1)将定量好的粪便蛋白加入5
×
loading buffer蛋白上样缓冲液，使得loading buffer蛋白上样缓冲液的终浓度为1
×
loading buffer；
[0014](2)然后在100℃下煮沸10min，置于冰上放置保存10min；
[0015](3)按照40μg的蛋白上样量经SDS
‑
PAGE电泳；
[0016](4)将电泳后的PAGE胶取下，放入玻璃容器中，经双蒸水洗涤3次，每次5min；
[0017](5)弃去洗涤液，加入25mL的考马斯亮蓝染色液，置于摇床上缓慢摇动染色2h；
[0018](6)染色结束后移出染色液，加入25mL的脱色液，所述的脱色液为甲醇、水和乙酸
的混合液，其中甲醇：水：冰醋酸的体积比为5:4:1，并置于摇床缓慢摇动4h，期间每1h更换一次脱色液；
[0019](7)最后采集照片和分析结果。
[0020]本专利技术的优点：粪便含有丰富消化道的分泌物和脱落细胞，如脱落细胞中肿瘤标志物、细菌代谢产物、人体代谢产物等。其能很好地反映胃肠道、胰腺和肝胆相关脏器的功能状态。另外，粪便具有无创性和易获得性的优点，根据本专利技术所提供的一种人类粪便蛋白的提取及电泳分析方法，也为探索消化系统疾病提供一个无创性诊治的新研究体系。
附图说明
[0021]图1是提取人粪便蛋白的SDS
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PAGE电泳图。
具体实施方式
[0022]一种人类粪便蛋白的提取方法，包括以下步骤：
[0023](1)取新鲜的粪便样本，置于电子天平中称取1g于15mL第一离心管中；
[0024](2)向第一离心管中加入4mL的粪便蛋白裂解液，所述的粪便蛋白裂解液的制备方法为：取80mL的去离子水，依次加入0.9g的NaCl、20mmol的Tris
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HCl、1mL的Triton X
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100、200μg的抑肽酶和20μg的斑蝥素，加入NaOH调节pH值为7.5，加入适量的去离子水定容为100mL；
[0025](3)然后用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置5min，再次用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置20min；
[0026](4)将第一离心管在2500rpm下离心5min，吸取上清液并转移到1.5mL的第二离心管；
[0027](5)将第二离心管在12000rpm下离心10min，吸取上清液并转移到1.5mL的第三离心管，第三转移至第三离心管的上清液即为粪便蛋白裂解液；
[0028](6)将粪便蛋白裂解液经BCA法定量粪便样本中总蛋白质的浓度；
[0029](7)将定量好的粪便蛋白置于
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80℃冰箱保存备用。
[0030]根据上述人类粪便蛋白的提取方法提取的粪便蛋白进行SDS
‑
PAGE电泳分析的方法，包括以下步骤：
[0031](1)将定量好的粪便蛋白加入5
×
loading buffer蛋白上样缓冲液，使得loading buffer蛋白上样缓冲液的终浓度为1
×
loading buffer；
[0032](2)然后在100℃下煮沸10min，置于冰上放置保存10min；
[0033](3)按照40μg的蛋白上样量经SDS
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PAGE电泳；
[0034](4)将电泳后的PAGE胶取下，放入玻璃容器中，经双蒸水洗涤3次，每次5min；
[0035](5)弃去洗涤液，加入25mL的考马斯亮蓝染色液，置于摇床上缓慢摇动染色2h；
[0036](6)染色结束后移出染色液，加入25mL的脱色液，所述的脱色液为甲醇、水和乙酸的混合液，其中甲醇：水：冰醋酸的体积比为5:4:1，并置于摇床缓慢摇动4h，期间每1h更换一次脱色液；
[0037](7)最后采集照片和分析结果。
[0038]电泳图如图1所示，可以看出：
[0039]a、重复性好，每个粪便蛋白样品在不同分子量范围内的蛋白种类、大小较为均一；
[0040]b、灵敏度高，各个分子量范围内蛋白均可以提取；
[0041]c、由于添加了抑肽酶和斑蝥素，理论上减少磷酸化蛋白的降解；
[0042]d、样本量小，1g能够提取3mL的含有4000μg/mL的总蛋白。
[0043]临床上提取了正常人蛋白和结肠癌患者的粪便蛋白，用ELISA技术进行验证，发现结肠癌患者粪便蛋白中CAT,LTF,MMP9,RBP4和SERPINA3的表达均显著地高于正常人。通过对提取的粪便蛋白进一步医学分析，可以对患者病情诊断提供新的手段。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人类粪便蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜的粪便样本，置于电子天平中称取1g于15mL第一离心管中；(2)向第一离心管中加入4mL的粪便蛋白裂解液，所述的粪便蛋白裂解液的制备方法为：取80mL的去离子水，依次加入0.9g的NaCl、20mmol的Tris
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HCl、1mL的Triton X
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100、200μg的抑肽酶和20μg的斑蝥素，加入NaOH调节pH值为7.5，加入适量的去离子水定容为100mL；(3)然后用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置5min，再次用漩涡仪充分震荡30s，冰上静置20min；(4)将第一离心管在2500rpm下离心5min，吸取上清液并转移到1.5mL的第二离心管；(5)将第二离心管在12000rpm下离心10min，吸取上清液并转移到1.5mL的第三离心管，第三转移至第三离心管的上清液即为粪便蛋白裂解液；(6)将粪便蛋白裂解液经BCA法定量粪便样本中总蛋白质的浓度；(7)将定量好的粪便蛋白置于
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【专利技术属性】
技术研发人员：耿志军，李静，左芦根，宋雪，张小凤，王炼，王月月，胡建国，
申请(专利权)人：耿志军，
类型：发明
国别省市：