一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法，属于食品检测技术领域。制备方法经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成，该法制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。经检验证明，本标准品无论是在冷冻还是高温情况下运输均可以保证产品质量，满足不同区域的运输要求，保质期长，是一种有效可靠的实体标准样品，可用于相关的检测分析领域的质量控制，还可作为一种手段对参加检测的实验室或技术人员的分析能力进行认证考核，具有显著的经济价值和市场竞争力。有显著的经济价值和市场竞争力。有显著的经济价值和市场竞争力。

【技术实现步骤摘要】
一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法，属于食品检测


技术介绍

[0002]赭曲霉毒素A（OTA）主要由曲霉属或青霉属的一些真菌产生，是一种无色结晶化合物，可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。其苯溶剂化物熔点94～96℃，二甲苯中结晶熔点169℃，有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A是一种毒性较强的真菌毒素，被国际癌症研究机构归为对人类可能致癌的毒素（2B）。
[0003]OTA污染的问题经常发生。根据有关报道，我国葡萄酒中OTA的含量范围为0.1～5.65μg/L。葡萄酒中的OTA会通过影响酵母菌的生长代谢而给产品品质带来不利影响。我国在发布的国标GB2761
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2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中也规定了葡萄酒中OTA的最大限量值为2.0μg/kg。因此对葡萄酒中赭曲霉毒素A进行检测是十分有必要的。目前的质量控制手段是将待测葡萄酒样品中添加纯的赭曲霉毒素A标准品后进行检测分析，但这种方式会受标准品的准确度和实验人员的操作能力的影响，而且由于OTA大部分是因为吸附作用残存在固体果渣和生物体中，直接加标的方式无法真实反映毒素在葡萄酒中的存在状态，因此方法的准确性不能得到保证。目前，已有研究证明在葡萄酒的罐装储存过程中也会有一定程度OTA降解，这使得OTA在葡萄酒基质中长期真实且稳定存在较为困难。因此需要研发一种以葡萄酒为基体的赭曲霉毒素A标准样品作为检测的质控手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是，针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，该法经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成，该法制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。
[0005]本专利技术的另一目的是，提供一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品，具有均匀性好、稳定性高的优点。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，包括以下步骤：步骤一，将炭黑曲霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待充分产孢后，洗下孢子，过滤除掉菌丝，得到孢子菌悬液；然后用无菌水调节菌悬液浓度为1
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106个/mL备用；步骤二，取成熟葡萄，用酒精清洗灭菌；步骤三，将表面晾干后的葡萄进行除梗，再对葡萄进行破碎，破碎后的葡萄进行压榨，分离汁液与残渣；
步骤四，将制备好的菌悬液均匀喷洒在残渣表面，在25℃的无菌培养箱中培养7天，残渣厚度为1cm，菌悬液喷洒量为1mL/cm2；步骤五，将培养后的残渣经121℃、20分钟灭菌后，待冷却至室温后，进行冷冻干燥，冻干后粉碎，过30目筛子，筛下物混匀后，得到冻干粉；步骤六，将酵母活化后，按0.1g/L接种至汁液中发酵，发酵温度15
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20℃，不密封发酵8天后，添加乙醇溶液调整酒精度为16%，4℃贮藏，获得发酵葡萄酒；步骤七，将冻干粉与发酵葡萄酒混匀，发酵葡萄酒和冻干粉的混合比例为75mL发酵葡萄酒/g冻干粉，混匀后在2
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4℃下过滤，获得葡萄酒；步骤八，将葡萄酒进行二次混匀搅拌，灌装后置于2~8℃下冷藏保存。
[0007]步骤一中，炭黑曲霉菌的培养温度为25℃，培养时间为6天；过滤为用无菌纱布过滤。
[0008]步骤二中，酒精的浓度为75%。
[0009]步骤三中，破碎的方法为采用破壁机进行破碎；压榨的方法为采用压榨机进行压榨。
[0010]步骤五中，灭菌的方法为采用高压灭菌锅进行灭菌；冷冻干燥的方法为：
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80℃冰箱预冻10h、
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40℃冷冻干燥1h、
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30℃冷冻干燥4h、
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20℃冷冻干燥8h、
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10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥4h、10℃冷冻干燥2h、20℃冷冻干燥1h；粉碎的方法为：刀质粉碎机中，以2000r/min，粉碎30min；筛下物混匀的方法为：用高效混合机以1000r/min混合20min。
[0011]步骤六中，酵母为X16菌株，酵母活化方法为：在35℃下活化2h。
[0012]步骤七中，混匀的方法为：通过顶置搅拌器500r/min搅拌30min。
[0013]步骤七中，过滤的方法为：通过板式膜过滤器过膜过滤，板式膜过滤器的滤膜为聚四氟乙烯PTFE滤膜，滤膜的大小为0.35
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10μm。
[0014]步骤二中，葡萄种类包括赤霞珠。
[0015]本专利技术的制备方法获得的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品，其特征在于，标准样品在4
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50℃储存环境下有效期为6个月，标准值为4.00μg/kg。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术提供了一种葡萄酒中赭曲霉毒素A基体标准样品的制备方法，结合按照葡萄酒的生产过程，经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成。本专利技术制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。经检验证明，本标准品无论是在冷冻还是高温情况下运输均可以保证产品质量，满足不同区域的运输要求，保质期长，是一种有效可靠的实体标准样品，可用于相关的检测分析领域的质量控制，还可作为一种手段对参加检测的实验室或技术人员的分析能力进行认证考核，具有显著的经济价值和市场竞争力。
[0017]2.本专利技术的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品将主要应用于实验室能力验证、内部质控、方法验证等活动；有助于实验室质量控制，使定量检测结果准确性得到保证；有助于加强葡萄酒生产质量安全控制，提升检验检测机构农药残留检测水平。
[0018]3.均匀性是标准物质的基本属性。真实的实物标准样品由于其制备方法困难，投入资金高，投入时间长，目标成分代谢规律不明确等等多种因素影响，要获得均匀性合格的
标准样品比较困难。而本专利技术确定了在规定的条件下，对葡萄压榨后的汁液和残渣分离处理，通过添加配料、加压过滤工艺制备的样品能够获得较好的均匀性。
[0019]4.稳定性也是标准物质的基本属性，标准样品从制备到使用涉及贮存和运输过程，这可能会导致标准样品稳定性的变化，因此需要进行两方面的稳定性评估，一是依据样品包装和运输的形式，选择短期稳定性评估的温度。通常是在不同的温度条件下进行，考察温度对于标准物质特性值的影响；二是在规定的贮存条件下，在较长周期内定期对标准物质特性值进行检测，考察其保持在规定范围内的能力。按本专利技术制备的标准样品短期稳定性和长期稳定性均符合要求，在4
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50℃储存环境下有效期为6个月。本专利技术实施例1的A样品经8家实验室检测，确定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将炭黑曲霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待充分产孢后，洗下孢子，过滤除掉菌丝，得到孢子菌悬液；然后用无菌水调节菌悬液浓度为1
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106个/mL备用；步骤二，取成熟葡萄，用酒精清洗灭菌；步骤三，将表面晾干后的葡萄进行除梗，再对葡萄进行破碎，破碎后的葡萄进行压榨，分离汁液与残渣；步骤四，将制备好的菌悬液均匀喷洒在残渣表面，在25℃的无菌培养箱中培养7天，残渣厚度为1cm，菌悬液喷洒量为1mL/cm2；步骤五，将培养后的残渣经121℃、20分钟灭菌后，待冷却至室温后，进行冷冻干燥，冻干后粉碎，过30目筛子，筛下物混匀后，得到冻干粉；步骤六，将酵母活化后，按0.1g/L接种至汁液中发酵，发酵温度15
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20℃，不密封发酵8天后，添加乙醇溶液调整酒精度为16%，4℃贮藏，获得发酵葡萄酒；步骤七，将冻干粉与发酵葡萄酒混匀，发酵葡萄酒和冻干粉的混合比例为75mL发酵葡萄酒/g冻干粉，混匀后在2
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4℃下过滤，获得葡萄酒；步骤八，将葡萄酒进行二次混匀搅拌，灌装后置于2~8℃下冷藏保存。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，炭黑曲霉菌的培养温度为25℃，培养时间为6天；过滤为用无菌纱布过滤。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，酒精的浓度为75%。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，破碎的方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，陈冬东，耿旭浩，霍思宇，余丽波，卜丹丹，董静，贾景建，王一名，汪春明，白雅欣，顾传启，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院中检科北京测试认证有限公司，
类型：发明
国别省市：