一种基于细胞膜打孔诱导胞内抗原释放的方法技术

本公开提供了一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法，所述方法包括：在表达胞内抗原的肿瘤细胞上构建不同GSDME表达水平的细胞系，包括GSDME敲除细胞系和GSDME高表达细胞系，并筛选GSDME高表达和GSDME敲除的表达胞内抗原的肿瘤细胞系；使用Caspase

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞膜打孔诱导胞内抗原释放的方法


[0001]本公开涉及生物细胞的
，尤其涉及一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法。

技术介绍

[0002]细胞膜损伤导致细胞胞内抗原释放能够引起免疫系统的活化，同时也能促进靶向胞内抗原的抗体结合。肿瘤细胞的胞内抗原释放能够通过诱导抗肿瘤特异性免疫，进而促进肿瘤免疫治疗，细胞膜的屏障作用使得胞内蛋白无法自由释放到细胞外。因此，需要一种诱导胞内抗原释放的方法。

技术实现思路

[0003]本公开提供了一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
[0004]本公开提供了一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法，所述方法包括：
[0005]在表达胞内抗原的肿瘤细胞上构建不同GSDME表达水平的细胞系，包括GSDME敲除细胞系和GSDME高表达细胞系，并筛选GSDME高表达和GSDME敲除的表达胞内抗原的肿瘤细胞系；
[0006]使用Caspase
‑
3活化药物刺激不同GSDME蛋白表达水平的胞内抗原的肿瘤细胞，以使肿瘤细胞内抗原释放。
[0007]在一可实施方式中，所述筛选GSDME高表达胞内抗原的肿瘤细胞系，包括：
[0008]构建载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒；
[0009]培养表达tfRFP的肿瘤细胞，并将构建的载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒和转染脂质体混合孵育后，转染到肿瘤细胞中进行表达，筛选出稳定表达GSDME的肿瘤细胞。
[0010]在一可实施方式中，所述构建载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒，包括：
[0011]使用内切酶切开PB载体，使PB载体线性化；
[0012]获取人源或鼠源细胞中GSDME的cDNA，以cDNA为模板，通过引物PCR扩增GSDME片段；
[0013]在GSDME片段3
’
端和荧光蛋白5
’
端
’
引入重叠片段；同时以含荧光蛋白的质粒为模板，通过引物PCR扩增出前后有重叠区域的荧光蛋白片段，得到载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒。
[0014]在一可实施方式中，扩增GSDME片段，正向引物：ATCATTTTGGCAAAGCTTAAG
‑
GCCACC
‑
ATGTTTGCCAAAGCAAC，反向引物：GCTGCCGCCGCCGGAGCCTCCGCC
‑
GTCTTGACCTGTAGCATG；扩增荧光蛋白片段，
[0015]正向引物：CTCCGGCGGCGGCAGC
‑
ATGGTGAGCAAGGGCGAG，
[0016]反向引物：GAGGAGTGAATTTCGAATTC
‑
CTACTTGTACAGCTCGTCC。
[0017]在一可实施方式中，所述筛选GSDME敲除的表达胞内抗原的肿瘤细胞系，包括：
[0018]构建敲除GSDME蛋白的px458质粒；
[0019]培养表达tfRFP的肿瘤细胞，并将构建的敲除GSDME蛋白的px458质粒和转染脂质体混合孵育后，转染到肿瘤细胞中进行表达，筛选出稳定表达GSDME的肿瘤细胞。
[0020]在一可实施方式中，所述构建敲除GSDME蛋白的px458质粒，包括：
[0021]合成gRNA对应的引物，包括gRNA1和gRNA2，其中gRNA1对应的正向引物：CACC
‑
GTGTGAGAACCATAAGAGCG，反向引物：AAAC
‑
CGCTCTTATGGTTCTCACAC；gRNA2对应的正向引物：CACC
‑
GGGCTATTGGGACAGTCGTG，反向引物：AAAC
‑
CACGACTGTCCCAATAGCCCC；将引物退火后，得到gRNA表达片段；
[0022]使用Bbs1酶切空载的px458质粒，将gRNA表达片段连入酶切的px458载体中，得到包含gRNA的px458质粒，分别为px458
‑
gRNA1和px458
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gRNA2。
[0023]在一可实施方式中，gRNA1表达片段的碱基序列为：GTGTGAGAACCATAAGAGCG；gRNA2表达片段的碱基序列为：GGGCTATTGGGACAGTCGTG。
[0024]在一可实施方式中，对活化药物诱导后的不同GSDEM表达水平的表达tfRFP的肿瘤细胞进行荧光显微成像。
[0025]本公开提供一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法，通过在表达胞内抗原的肿瘤细胞上构建不同GSDME表达水平的细胞系，再使用Caspase
‑
3活化药物刺激不同GSDME蛋白表达水平的胞内抗原的肿瘤细胞，以使肿瘤细胞内抗原释放。其中GSDME蛋白能够在caspase
‑
3、颗粒酶B的作用下形成GSDME
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NT(氮端GSDME蛋白)聚集体，进而在细胞膜内部打孔，胞内抗原能够通过GSDME
‑
NT孔洞释放到胞外，细胞膜打孔能够破坏细胞膜的屏障作用，诱导胞内抗原的释放。
[0026]应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
[0027]通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
[0028]在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
[0029]图1示出了本公开实施例一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法的流程示意图；
[0030]图2示出了本公开实施例PB
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GSDME
‑
GFP质粒图谱示；
[0031]图3示出了本公开实施例px458
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gRNA质粒图谱；
[0032]图4示出了表达GSDME
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GFP的细胞和敲除GSDME蛋白的细胞的蛋白质印迹检测，其中(A)转染表达GSDME
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GFP的GSDME
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GFP
mid
tfRFP
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B16细胞和GSDME
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GFP
hi
tfRFP
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B16细胞蛋白质印迹结果；(B)蛋白质印迹检查GSDME蛋白敲除的tfRFP
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B16细胞；
[0033]图5示出了原子力显微镜检测caspase
‑
3活化对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞膜打孔诱导细胞内抗原释放的方法，其特征在于，所述方法包括：在表达胞内抗原的肿瘤细胞上构建不同GSDME表达水平的细胞系，包括GSDME敲除细胞系和GSDME高表达细胞系，并筛选GSDME高表达和GSDME敲除的表达胞内抗原的肿瘤细胞系；使用Caspase
‑
3活化药物刺激不同GSDME蛋白表达水平的胞内抗原的肿瘤细胞，以使肿瘤细胞内抗原释放。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选GSDME高表达胞内抗原的肿瘤细胞系，包括：构建载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒；培养表达tfRFP的肿瘤细胞，并将构建的载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒和转染脂质体混合孵育后，转染到肿瘤细胞中进行表达，筛选出稳定表达GSDME的肿瘤细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构建载体
‑
GSDME
‑
荧光蛋白质粒，包括：使用内切酶切开PB载体，使PB载体线性化；获取人源或鼠源细胞中GSDME的cDNA，以cDNA为模板，通过引物PCR扩增GSDME片段；在GSDME片段3
’
端和荧光蛋白5
’
端
’
引入重叠片段；同时以含荧光蛋白的质粒为模板，通过引物PCR扩增出前后有重叠区域的荧光蛋白片段，得到载体
‑
GSDME
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荧光蛋白质粒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增GSDME片段，正向引物：ATCATTTTGGCAAAGCTTAAG
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GCCACC
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ATGTTTGCCAAAGCAAC，反向引物：GCTGCCGCCGCCGGAGCCTCCGCC
‑
GTCTTGACCTGTAGCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智红，代博雷，祁淑红，章仁，
申请(专利权)人：海南大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：