中国林蛙皮ｃＤＮＡ文库制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域及生物制药领域，具体涉及一种中国林蛙皮ｃＤＮＡ文库及其构建方法，并涉及从所构建的ｃＤＮＡ文库中筛选具有抗临床多重耐药菌活性的抗菌肽基因。构建文库所需中国林蛙（Ｒａｎａ　ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ　ｃｈｅｎｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｄａｖｉｄ）为长白山区人工放养，蛙皮为秋季林蛙排卵之前采集。得到的文库特征为，ｃＤＮＡ片段大约分布在０．３～６ｋｂ，文库滴度２．４×１０５ｐｆｕ／ｍＬ，重组率达到９９．４％。可从文库中筛选广谱、高效的抗菌肽基因，一方面可以为开发研究新的抗菌肽提供依据；另一方面可以使定向改变抗菌肽的抗菌谱、溶解度、稳定性范围等成为可能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域及生物制药领域，具体涉及一种中国林蛙皮 cDNA文库及其构建方法，并涉及从所构建的cDNA文库中筛选具有抗临床多重 耐药菌活性的抗菌肽基因。
技术介绍
人类与环境微生物的抗争一直持续在人类进化过程之中，1941年开始的青霉素的临床使用加剧了人与环境微生物的拮抗。近半个多世纪以来，微生物耐药 性突变株的产生与新型抗菌剂的发现一直吸引着人们的注意，这关乎着人类的健 康与环境的和谐。自从二十世纪八十年代瑞典科学家Boman HG等人从惜古比天蚕 (Hyatophora cecropia)蛹中诱导分离得到杀菌肽(bactericidal proteins),命名为 cecropin后，每年都有多种抗菌肽被分离、纯化。抗菌肽具有分子量小、热稳定 性好、水溶性好、抗菌谱广以及材料来源丰富等特点。抗菌肽的来源复杂多样， 从植物到动物甚至人体组织，都分离、纯化得到过抗菌肽。其中两栖类动物生存 环境复杂多样，它们的皮肤在维持生存、开拓和适应广阔栖息地中起着重要作用。 为了适应生存环境，两栖类的皮肤中分布了种类繁多、功能复杂的活性物质，是 一个巨大的活性生物分子资源库和药物资源库，使得两栖类的皮肤成为人们分离 抗菌肽的一大研究热点。继1987年Zasloff. M课题组从非洲爪蟾Xenopus laevis 皮肤中分离出magainins后，每年都有大量的抗菌肽从两栖纲无尾目类动物(青 蛙和蟾蜍)的皮肤中获得。抗菌肽在最低抑菌浓度(MIC)下对细菌质膜的破坏 作用被认为是抗菌肽主要的抗菌机理，但是在实际研究中人们发现部分抗菌肽种 类可以跨菌膜存在，并且进一步抑制生物大分子的合成，影响部分酶的活性，甚 至影响细胞的分化或剌激细胞自动裂解。 一般说来，在抗菌肽的最低抑菌浓度和 最低杀菌浓度(MBC)非常接近(小于2倍)的情况下，认为抗菌肽是起到杀菌的 作用而非抑菌；相反，如果MIC和MBC浓度比超过两倍则可以认为抗菌肽是 起到抑菌作用，多数抗菌肽属于杀菌作用机理。抗菌肽不能够被已知的耐药菌的 抗抗生素机制所抑制，这一点已经被部分研究所证实。而且研究表明抗菌肽在微 克分子浓度时对肿瘤细胞和病毒都有杀伤作用，但对没有病变的动物细胞没有作 用。这是目前使用的各种肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现 有抗生素逐步产生耐药性，而新的抗生素的发现又极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。但是，天然 抗菌肽在动植物体内含量极微，仅靠提取得到抗菌肽不仅产量低、费时长、工艺 复杂，而且花费昂贵，很难实现大规模生产。因此，开展抗菌肽基因工程研究具 有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建中国林蛙皮的cDNA文库，用以筛选高抗菌活性的 抗菌肽。并从中筛选得到具有抗临床多重耐药菌活性的林蛙抗菌肽。为了实现上 述目的，采取以下步骤构建cDNA文库1、 蛙皮中总RNA提取及mRNA纯化用v-gene纯化试剂盒(v-gene)纯化mRNA，用分光光度法估测总RNA含量 和纯度.2、 cDNA合成和重组载体的构建按universal riboclone cDNA synthesis system操作指南(promega)， 以random hexameric primers为引物，经反转录合成第1链cDNA;再以DNAPolymerase I合 成第2链.用T4DNA连接酶在cDNA的5'端连接EcoR I衔接头，用Not I酶切 cDNA，使cDNA的3'末端形成Not I突出末端，以便于将cDNA定向克隆到载 体中，酚:氯仿抽提cDNA。按试剂盒操作说明，以T4DNA连接酶将cDNA定向 连接至U不同比例的X phage载体(packagene lambda DNA packaging system promega)上，以选择最佳连接比例。噬菌体包装、宿主菌(LE392)的感染和文库 的扩增等按常规操作。3、 cDNA文库的滴度和重组率的测定从cDNA文库中取出5nL ，按1 : 1 000 、 1 : 10 000的比例稀释，转染宿主菌大肠杆菌(LE392)，铺于含IPTG和X-gal的平板上，培养过夜后，计算噬菌斑的个数，按下面公式推算文库的滴度。a&wa 噬菌斑数x稀释倍数 文库滴度(pfUZmL)- -转染的体积分别记数蓝斑和白斑的个数，计算重组率。附图说明图1: cDNA 1 %琼脂糖凝胶电泳。具体实施方式实施例1:林蛙皮cDNA文库构建方法cDNA文库构建所需中国林蛙及fliia te附/wiwto c/teitsZ/fe附&, Z)flv/V/为长白山区人工放养，蛙皮为秋季林蛙排卵之前采集。针刺活蛙枕骨大孔后，扒取蛙皮， 迅速置液氮冻存。1. 蛙皮中总RNA提取及mRNA纯化取冻存的蛙皮约100mg，加入匀浆缓冲液，冰上匀浆。匀浆液置37。C温浴 lh后，加入等体积的酚:氯仿抽提液，剧烈震荡lmin， 5,000xg离心10min;上层 水相按同法再抽提1次;第2次抽提的上层水相中加入0.1倍体积的3M醋酸钠 (pH5,2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，冰浴2h;4。C， 5，000xg离心15min，弃上 清，用冰冷的75%乙醇洗沉淀；4°C， 5,000xg离心15min，弃上清；真空干燥 15min，沉淀用DEPC处理的水溶解;加等体积的8M尿素-3M LiCl溶液(DEPC处 理)于-20。C过夜沉淀后，4°C， 10,000xg离心30min，小心弃上清，加75%乙醇 洗沉淀；4°C， 10，000xg离心10min，真空干燥，沉淀用DEPC处理的水溶解， 取500n g的总RNA，立即用v-gene纯化试剂盒(v-gene)纯化mRNA，用分光光 度法估测总RNA含量和纯度.2. cDNA合成和重组载体的构建按universal riboclone cDNA synthesis system操作指南(promega)， 以randomhexameric primers为引物，经反转录合成第1链cDNA;再以DNAPolymerase I合成 第2链.用T4DNA连接酶在cDNA的5'端连接EcoR I衔接头，用Not I酶切cDNA， 使cDNA的3'末端形成NotI突出末端，以便于将cDNA定向克隆到载体中，酚: 氯仿抽提cDNA。按试剂盒操作说明，以T4DNA连接酶将cDNA定向连接到不同 比例的X phage载体(packagene lambda DNA packaging system promega)上，以选择 最佳连接比例(表l)。噬菌体包装、宿主菌(LE392)的感染和文库的扩增等按常规 操作。电泳结果见图l，其中带1: Marker;带2: cDNA。3. cDNA文库的滴度和重组率的测定表l 预连接反应<table>table see original document page 5</column></row><table>(lOng/pl; O.Olpmol/pl)T4 DNA Ligase 10X Buffer1111Nuclease-Fr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中国林蛙（Ｒａｎａ　ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ　ｃｈｅｎｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｄａｖｉｄ）皮ｃＤＮＡ文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：滕利荣，周杰，程瑛琨，孟庆繁，丁天兵，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]