一种一体化防污染检测管和基于其的核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种一体化防污染检测管和基于其的检测方法，属于核酸分子诊断技术领域。所述一体化防污染检测管包括扩增管，扩增管外部套设有检测管，扩增管内部设有裂解管，检测管顶部设有管帽；其中，裂解管包括底部设置的裂解管密封石蜡，扩增管包括底部设置的扩增管密封石蜡；石蜡是掺杂有直径为10nm氧化铁纳米颗粒的混合石蜡。基于所述一体化防污染检测管的核酸检测方法，缩减了开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，通过简单激光灯照射、离心步骤即可，简化了操作步骤，提高了检测效率；同时避免了因开盖、样本核酸的转移等操作引起的实验室气溶胶污染等问题。验室气溶胶污染等问题。验室气溶胶污染等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种一体化防污染检测管和基于其的核酸检测方法


[0001]本专利技术属于核酸分子诊断
，涉及一种一体化防污染核酸检测管和基于其的CRISPR分子诊断检测方法。

技术介绍

[0002]CRISPR全称为“规律成簇的间隔短回文重复序列”（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）是一种广泛存在于古细菌和细菌的适应性免疫系统。2017年，基因编辑领域国际顶尖学者哈佛大学博德研究所张锋教授团队将CRISPR技术应用到核酸检测领域，在其和加州大学伯克利分校的JenniferDoudna团队共同努力下，该技术已被用于检测多种病原生物的核酸分子（如寨卡病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌等）。此后，以Cas12、Cas13、Cas14等CRISPR酶为基础的各种核酸检测平台也应运而生。CRISPR技术相比较传统的核酸检测方法不仅在检测的成本、效率、便携性、特异性、简便性等方面都显示出了巨大的优势，同时该项技术还具有较好的生物相容性，能够跟其他技术结合，从而更加简便高灵敏的进行核酸检测，该项技术也被誉为下一代的新型核酸检测技术。
[0003]但是CRISPR核酸检测技术还存在一些问题，在进行CRISPR核酸检测反应前通常需要先对样本核酸进行裂解和扩增，然后在将样本核酸加入到CRISPR反应体系实现检测。在这个过程中需经过检测管的开盖、试剂的转移和检测管的闭盖等操作，这样不仅极易造成实验室气溶胶污染，导致后续结果出现较高的假阳性问题而且也极易造成实验室以及相关器材的交叉污染，同时还需要耗费大量的时间去完成一系列操作，造成人力物力的浪费。因此急需寻找到一种方便可行的装置或者方法在不降低灵敏度的情况下，实现样本核酸的样本进
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结果出的一体化、简单无污染操作。

技术实现思路

[0004]为了实现基于CRISPR的一体化、简便、无污染核酸检测，本专利技术的目的在于提供一种一体化防污染检测管和基于其的分子诊断检测方法。本专利技术的目的在于解决以CRISPR技术为基础的核酸检测过程中因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，造成假阳性或灵敏度降低，且无法实现一体化得到检测结果的问题；本专利技术提供的一体化防污染检测管能够保证以CRISPR技术为基础的核酸检测在不降低灵敏度、不导致假阳性的前提下，使检测系统具有较高的鲁棒性，减少实验操作，防止污染，提高核酸检测的效率。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种一体化防污染检测管，包括扩增管，扩增管外部套设有检测管，扩增管内部设有裂解管，检测管顶部设有管帽；其中，裂解管包括底部设置的起到密封作用的石蜡，扩增管包括底部设置的起到密封作用的石蜡。
[0006]优选地，扩增管包括固定连接的第一空心圆柱体上体、第一类锥形中体和第一空心圆柱体下体，第一空心圆柱体下体的收口侧设有开口，石蜡设于所述开口进行密封；检测管包括固定连接的第二空心圆柱上体和底部封闭的第二类锥形下体；裂解管包括第三空心
圆柱体和第三类锥形下体，石蜡设于第三类锥形下体底部进行密封。
[0007]优选地，裂解管、扩增管、检测管和管帽的材质为原生聚丙烯。
[0008]优选地，裂解管、扩增管、检测管和管帽之间依次通过间隙配合连接。
[0009]优选地，裂解管、扩增管、检测管和管帽之间依次通过螺纹配合连接。
[0010]优选地，裂解管密封石蜡和扩增管密封石蜡均为掺杂直径为10nm氧化铁纳米颗粒的石蜡。
[0011]进一步优选地，裂解管密封石蜡和扩增管密封石蜡可依据所需尺寸提前加工，然后通过过盈配合实现裂解管和扩增管的密封；或将裂解管和扩增管的开口底部放置在熔融状态的石蜡中，待石蜡冷却，实现裂解管和扩增管的密封。
[0012]本专利技术公开了基于上述防污染检测管的一种CRISPR分子诊断检测方法，包括以下步骤：1）将核酸扩增试剂干粉置于扩增管后，将裂解管固定于扩增管中部；将CRISPR试剂冻干置于检测管后，将扩增管固定于检测管中上部；将核酸裂解试剂置于裂解管后，盖上管帽；得到待检测试剂管；2）打开管帽，将待检测的样本核酸加入步骤1）所得待检测试剂管的裂解管中；盖上管帽，在恒温环境中进行待检测的样本核酸的核酸裂解反应程序；3）核酸裂解反应结束后，使用1.5w 808nm的激光灯照射裂解管密封石蜡（5）处，石蜡融化，经一阶段正反离心混匀，进行核酸扩增反应的程序；4）核酸扩增反应结束后，使用1.5w 808nm的激光灯照射扩增管密封石蜡（6）处，石蜡融化，经二阶段正反离心混匀，进行核酸检测反应的程序；5）最后通过UV灯或将检测试管放置到蓝光切胶仪上照射得到CRISPR分子诊断的检测结果。
[0013]优选地，步骤2）中，核酸裂解反应的恒温环境为38℃~40℃，时间为15~20min；步骤3）中，核酸扩增反应的温度为38℃~40℃，时间为12~18min；步骤4）中，核酸检测反应的温度为38℃~40℃，时间为12~18min；步骤3）中一阶段正反离心的转速为600~6000rpm，一阶段正转离心的时间为3~5s，反转离心的时间为3~5s，正反转各交替3~5次；步骤4）中，二阶段正反离心的转速为600~6000rpm，二阶段正转离心的时间为3~5s，反转离心的时间为3~5s，正反转各交替3~5次；步骤3）中1.5w 808nm的激光灯照射时间为1~2s；步骤4）中1.5w 808nm的激光灯照射时间为5~7s。
[0014]进一步优选地，步骤2）中，酸裂解反应的恒温环境为39℃，时间为15min；步骤3）中，核酸扩增反应的温度为39℃，时间为12min；步骤4）中，核酸检测反应的温度为39℃，时间为15min；步骤3）中，一阶段正反离心的转速为1000rpm，正反各三次，每次正反离心的时间各为4s；步骤4）中，二阶段正反离心的转速为1000rpm，正反各三次，每次正反离心的时间各为4s；步骤3）中1.5w 808nm的激光灯照射时间为2s；步骤4）中1.5w 808nm的激光灯照射时间为5s。。
[0015]优选地，将步骤1）所得待检测试剂管直接保存，用于CRISPR分子诊断的直接检测取用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种防污染检测管，通过由内向外依次套设的裂解管、扩增管和检
测管，能够将CRISPR分子诊断中所需的三个检测阶段分为独立的三部分检测空间，通过使用掺杂不同浓度的氧化铁纳米颗粒的石蜡密封裂解管和扩增管，实现裂解试剂和扩增试剂的分开存储，然后在通过808nm的激光灯照射，致使掺杂不同浓度的氧化铁纳米颗粒的石蜡在不同的照射时间内融化，实现试剂从内到外分批次混合，满足上述三个检测阶段的分阶段进行。因此，本专利技术所述防污染检测管其结构设计合理，形成了独立分隔且全封闭的检测管结构，避免了因为开盖、样本核酸的转移、闭盖等操作，引起的实验室气溶胶污染等问题，同时实现了样本进、结果出的一管操作，简化了核酸检测过程中的操作步骤，增强了核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种一体化防污染检测管，其特征在于，包括检测管（2），检测管（2）内部套设有扩增管（4），扩增管（4）内部设有裂解管（3），检测管（2）顶部设有管帽（1）；其中，裂解管（3）包括底部起到密封作用的裂解管密封石蜡（5），扩增管（4）包括底部起到密封作用的扩增管密封石蜡（6）；检测管（2）和管帽（1）之间通过螺纹配合连接或者通过过盈配合连接。2.根据权利要求1所述的一种一体化防污染检测管，其特征在于，扩增管（4）包括固定连接的第一空心圆柱体上体、第一类锥形中体和第一类空心圆柱体下体，第一类空心圆柱体下体的收口侧设有开口，扩增管密封石蜡（6）设于所述开口进行密封；检测管（2）包括固定连接的第二空心圆柱体上体和底部封闭的第二类锥形下体；裂解管（3）包括第三空心圆柱上体和第三类锥形下体，第三类锥形下体的收口侧设有开口，裂解管密封石蜡（5）设于所述开口进行密封。3.根据权利要求1所述的一种一体化防污染检测管，其特征在于，为方便检测管（2）、裂解管（3）和扩增管（4）的装配以及试剂装填的便捷化，裂解管（3）和扩增管（4）装配完成之后，裂解管（3）的顶部高于扩增管（4）的顶部。4.根据权利要求1所述的一种一体化防污染检测管，其特征在于，裂解管（3）、扩增管（4）和检测管（2）之间依次通过间隙配合进行装配。5.根据权利要求1所述的一种一体化防污染检测管，其特征在于，裂解管密封石蜡（5）和扩增管密封石蜡（6）均为掺杂直径为10nm氧化铁纳米颗粒的石蜡；裂解管密封石蜡（5）掺杂的氧化铁纳米颗粒浓度比扩增管密封石蜡（6）掺杂的浓度高。6.根据权利要求5所述的一种一体化防污染检测管，其特征在于，石蜡（5）和石蜡（6）可依据所需尺寸提前加工，然后通过过盈配合实现裂解管（3）和扩增管（4）的密封；或将裂解管（3）和扩增管（4）的开口底部放置在熔融状态的石蜡中（石蜡熔融状态下，高度方向尺寸0.5mm~0.8mm），待石蜡冷却，实现裂解管（3）和扩增管（4）的密封。7.基于权利要求1~6任意一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳飞，魏伟，焦孙治，杨衍帅，张瑞丰，杜晓彤，米振涛，郭智春，
申请(专利权)人：中国机械总院集团青岛分院有限公司，
类型：发明
国别省市：