高活性苦荞清蛋白降血压肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了高活性苦荞清蛋白降血压肽的制备方法，属于食品及药品领域。本发明专利技术通过从苦荞中提取出苦荞清蛋白，采用人体消化所必须的两种蛋白酶进行酶解，并优化了胃蛋白酶

【技术实现步骤摘要】
高活性苦荞清蛋白降血压肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及高活性苦荞清蛋白降血压肽的制备方法，属于食品及药品领域。

技术介绍

[0002]高血压是一种常见的慢性心血管疾病，长期性的高血压容易引发脑卒中、冠心病等疾病，且大多数高血压患者需要终身服药。血管紧张素转化酶(ACE)，主要功能有两个：1.催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ；2.使缓激肽失活。血管紧张素转化酶因这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。目前对高血压的药物治疗已经相对成熟，如培哚普利和卡托普利等都能对ACE进行抑制，但是服用药物容易引发一系列的副作用，如机体产生耐药性、咳嗽、引起血管性水肿等。因此安全无毒副作用的食源性动植物蛋白进入人们的视野，早在1979年Oshima等采用细菌胶原蛋白酶水解明胶获得降血压肽；越来越多的研究证明动植物蛋白可制备出有效的降血压活性肽，为治疗高血压提供新的思路，为通过食疗等方法调控血压提供了理论依据。
[0003]有研究表明，生物活性肽段中含有疏水性氨基酸和脯氨酸对肽段的ACE抑制活性具有关键作用。koyama等人首次发现了荞麦抑制肽肽段Ser
‑
Thr
‑
Hyp，对自发性高血压大鼠有降血压作用；Li等人研究荞麦蛋白水解时，发现未经过蛋白提取的完整荞麦经过胃蛋白酶水解后对ACE的IC
50
为0.36mg蛋白质/ml，而未经过蛋白提取的完整荞麦用胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶水解后，IC
50
降低至0.14mg蛋白质/ml，说明胃蛋白酶处理后加入糜蛋白酶和胰蛋白酶可以极大提高荞麦蛋白的ACE抑制率。但是，由完整荞麦直接水解得到的酶解液虽然对ACE具有抑制作用，却并不能完全排除荞麦中其他成分对ACE抑制能力的影响。
[0004]苦荞是荞麦中的一种，又称鞑靼荞麦，是一种具有较高食用价值和药用价值的作物。药理研究表明，苦荞具有降血糖、降血压、降血脂以及抗氧化作用。其中，苦荞蛋白的调节脂代谢以及改善糖代谢功能均被研究证实。苦荞蛋白含有17种氨基酸，包括8种人体必需氨基酸，是一种全价蛋白质。目前从苦荞中制备出的降压肽对ACE抑制率较低。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]本专利技术要解决的技术问题是现有苦荞麦来源的降压肽对ACE的抑制率较低。
[0007][技术方案][0008]本专利技术提供制备具有降血压功能的来源于苦荞的蛋白肽的方法，包括以下步骤：
[0009](1)通过Osborne法从苦荞中提取出苦荞清蛋白；
[0010](2)取步骤(1)得到的苦荞清蛋白0.1
‑
0.9g，加入到磷酸盐缓冲液中，调整体系pH至2
‑
3，加入占苦荞清蛋白质量3
‑
6％的胃蛋白酶(2500U/mg)，于37℃酶解2h后，调整体系pH至7
‑
8，加入占苦荞清蛋白质量3
‑
6％的胰蛋白酶(1500U/mg)，于37℃酶解1h，获得酶解液；
[0011](3)将酶解液过微滤膜得到滤液，再用凝胶过滤层析对酶解液滤液中不同分子量的肽进行分离，筛选出对ACE抑制效果最佳的苦荞清蛋白活性肽；
[0012](4)使用nano
‑
HPLC
‑
MS/MS鉴定抑制效果最佳的苦荞清蛋白活性肽的氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(1)包括如下步骤：
[0014]①
磨粉：取苦荞于磨粉机中磨粉，过60
‑
80目筛，备用；
[0015]②
脱脂：向苦荞粉中加入石油醚，搅拌6
‑
10h，期间多次更换石油醚，直至上清液呈澄清状，风干备用；
[0016]③
提取苦荞清蛋白：称取300g脱脂苦荞粉，加入10倍体积水，40℃条件下搅拌提取2h，然后于5000r/min离心15min，离心所得上清液即为清蛋白提取液，调节清蛋白提取液pH至清蛋白的等电点，沉淀1h后，离心后取沉淀，将沉淀冻干后即为苦荞清蛋白。
[0017]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(2)所用胃蛋白酶可选择猪胃蛋白酶。
[0018]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(2)所用胰蛋白酶可选择猪胰蛋白酶。
[0019]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(3)：将酶解液经过0.22μm的微滤膜过滤，将滤液过Superdux peptide 10/300GL凝胶柱，以水为流动相，控制流速在0.4mL/min，用AKTA avant系统在280nm条件下按峰收集，得到三个峰F1、F2、F3，将三个峰组分稀释至相同浓度后分别测对ACE的抑制率，结果发现F3组分对ACE抑制率最高。
[0020]在本专利技术的某些实施方式中，步骤(4)使用nano
‑
HPLC
‑
MS/MS鉴定抑制效果最佳的苦荞清蛋白活性肽的氨基酸序列，共得到十条苦荞清蛋白降血压活性肽。
[0021]本专利技术提供具有降血压功能的活性肽，氨基酸序列分别是FLR、LPRL、LFGK、TLFR、IPRL、VVLK和SFFK。
[0022]所述活性肽可用于制备降压产品。产品中，可添加辅料，辅料用于赋形、充当载体、提高稳定性、增溶、助溶和/或缓控释。
[0023][有益效果][0024]本专利技术通过从苦荞中提取出苦荞清蛋白，采用人体消化所必须的两种蛋白酶进行酶解，并优化了胃蛋白酶
‑
胰蛋白酶酶解工艺，得到苦荞清蛋白肽，通过体外检测方法检测其对ACE活性抑制率；再将苦荞清蛋白肽通过凝胶过滤色谱分离得不同分子量的苦荞清蛋白肽并分别测其体外ACE活性抑制率；最后采用nano
‑
HPLC
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MS/MS鉴定对ACE活性具有最高抑制率的肽段的氨基酸序列。本专利技术得到10条具有降血压的高活性苦荞清蛋白肽，其氨基酸序列分别为IFR、LRF、FLR、LPRL、FLK、LFGK、TLFR、IPRL、VVLK和SFFK。其中，FLR、LPRL、LFGK、TLFR、IPRL、VVLK和SFFK是本专利技术首次发现的具有ACE抑制活性的肽。
[0025]本专利技术制备的高活性苦荞清蛋白降血压肽可进行包埋处理，增强进入人体后的稳定性；或者制成口服液产品，提高苦荞的附加值。通过本专利技术工艺制备的苦荞清蛋白降血压肽中所含的多肽序列明确且为本专利技术独有，为高活性苦荞清蛋白降血压肽作为食品或药品提供了理论依据。
[0026]本专利技术方法制备得到的苦荞清蛋白肽在未经过分离纯化时其IC
50
已经低至0.255mg/mL；经过凝胶过滤色谱分离后对ACE的抑制率显著提升，在0.1mg/mL时，抑制率达到71.83％。本专利技术从苦荞清蛋白中分离的降压肽对ACE的活性抑制效果更佳。
[0027]本专利技术利用两种蛋白酶连续水解，相较于碱性蛋白酶等水解方式，水解温和，对苦荞清蛋白的破坏程度较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备具有降血压功能的来源于苦荞的蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过Osborne法从苦荞中提取出苦荞清蛋白；(2)取步骤(1)得到的苦荞清蛋白0.1
‑
0.9g，加入到磷酸盐缓冲液中，调整体系pH至2
‑
3，加入占苦荞清蛋白质量3
‑
6％的胃蛋白酶，于37℃酶解2h后，调整体系pH至7
‑
8，加入占苦荞清蛋白质量3
‑
6％的胰蛋白酶，于37℃酶解1h，获得酶解液；(3)将酶解液过微滤膜得到滤液，再用凝胶过滤层析对酶解液滤液中不同分子量的肽进行分离，筛选出对ACE抑制效果最佳的苦荞清蛋白活性肽；(4)使用nano
‑
HPLC
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MS/MS鉴定抑制效果最佳的苦荞清蛋白活性肽的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的制备具有降血压功能的来源于苦荞的蛋白肽的方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：
①
磨粉：取苦荞于磨粉机中磨粉，过60
‑
80目筛，备用；
②
脱脂：向苦荞粉中加入石油醚，搅拌6
‑
10h，期间多次更换石油醚，直至上清液呈澄清状，风干备用；
③
提取苦荞清蛋白：称取300g脱脂苦荞粉，加入10倍体积水，40...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永富，杨楠，叶飞，黄金荣，王雅茹，史锋，
申请(专利权)人：无锡正大生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：