一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用。该菌株可以利用糖源、低元醇等多元化碳源，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖等为唯一碳源均可以快速生长。本发明专利技术首次发现库德里阿威兹毕赤酵母有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。库德里阿威兹毕赤酵母的菌体蛋白含量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本发明专利技术创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，未来将多种低值物料开发为单细胞蛋白方面具有应用前景。蛋白方面具有应用前景。蛋白方面具有应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母及其应用。

技术介绍

[0002]随着我国蛋白饲料原料进口量的不断提高，蛋白饲料原料短缺已经成为限制我国畜牧养殖业和饲料业健康发展的瓶颈，寻找和开发新的蛋白质资源成为饲料工业急需解决的问题。
[0003]根据蛋白质饲料来源不同可分为植物性蛋白饲料、动物性蛋白饲料、微生物蛋白（SCP、单细胞蛋白）饲料和非蛋白饲料。植物性蛋白饲料原料以豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕、苜蓿、玉米加工的副产品玉米蛋白粉等草本饲料为主，动物性蛋白饲料原料有鱼粉、肉骨粉、羽毛粉等，微生物蛋白饲料是由单细胞生物个体组成的蛋白质含量较高的饲料，如酵母菌饲料和单细胞藻类饲料，非蛋白氮饲料一般指饲料用尿素等。以价格低廉、存量丰富的低值碳源开发新型单细胞蛋白，形成具有价格优势的替代蛋白产品，是未来替代蛋白市场研究开发的重点。
[0004]我国资源现状是富煤、少油，甲醇是一种煤化工副产物，可由劣质煤炭制取，我国煤炭储量丰富，因此甲醇原料价格低廉且来源充足。另外，甲醇可由CO2加氢大量制备，因此其被认为是“液态阳光”战略的理想能量储存载体。我国甲醇市场规模居世界第一，产能已达8000万吨/年，呈现过剩趋势，甲醇经济的发展急需配套的甲醇转化利用技术。近年来，随着合成生物学技术的不断发展及其应用领域的不断扩大，以价格低廉的甲醇为碳源，利用微生物生产单细胞蛋白的技术逐渐受到关注。
[0005]巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是自然界中存在的一种能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的微生物，适合在学术或工业水平上分泌重组蛋白。相比与其他一些表达宿主，毕赤酵母具有很强的、甲醇诱导和严格调控的醇氧化酶启动子（AOX1），可以高效利用甲醇，在甲醇诱导作用下具有了高蛋白质分泌的能力，更适合表达高水平的外源基因。然而，巴斯德毕赤酵母属于商业菌株，知识产权不清晰。巴斯德毕赤酵母也属于转基因菌株，未能在饲用行业使用。亟待开发具有自主知识产权的、高效利用甲醇的野生型毕赤酵母菌株。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一株从白酒糟中筛选一株可以高效利用甲醇的酵母菌株，ITS鉴定为库德里阿威兹毕赤酵母，命名为库德里阿威兹毕赤酵母Kud
‑
A。该菌株可以利用糖源、低元醇等多元化碳源，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖等为唯一碳源均可以快速生长。本专利技术首次发现库德里阿威兹毕赤酵母Kud
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A可以利用甲醇，通过组学数据挖掘，发现该菌株有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。库德里阿威兹毕赤酵母Kud
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A菌体蛋白含
量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本专利技术创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，由此完成本专利技术。
[0007]本专利技术提供一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母，其是库德里阿威兹毕赤酵母（Pichia kudravzevii），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCC NO. 26899，保藏时间为：2023年2月24日，其分类命名为库德里阿威兹毕赤酵母Pichia kudravzevii
[0008]进而本专利技术提供所述的毕赤酵母的培养方法，其在含有氮源和碳源的培养基中进行有氧发酵培养。
[0009]优选地，其以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖或阿拉伯糖为唯一碳源进行培养。
[0010]更优选地，培养温度不超45℃，例如培养温度为35
‑
39℃。
[0011]进一步地，当以甲醇为唯一碳源时，甲醇浓度不超过3.5%（v/v）。
[0012]具体地，所述培养为在下述培养基中进行有氧发酵培养：42 g/L甘油，1.2 g/L KH2PO4，18 g/L NH4H2PO4，6.5 g/L MgSO4·
7H2O；培养条件：培养温度 30 ℃，pH值 4.5~ 5. 0，空气流量 4~8 m
3 / h，甘油按照0.5
‑
1.0 rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 24 h 后，补料甲醇0.1 rpm/h/次，维持DO≥25%。
[0013]本专利技术提供所述的培养方法得到单细胞蛋白。进一步提供所述的毕赤酵母在生产单细胞蛋白中的应用。
[0014]本专利技术首次发现该库德里阿威兹毕赤酵母有两套稳定的遗传代谢途径。该菌株最适生长温度为37℃，耐受至45℃；甲醇耐受强度为3.5%，该菌株鲁棒性极强，具有完美的工业属性。发酵得到的菌体蛋白含量>56%，氨基酸组成>42%，含有8种必需氨基酸，营养价值明显。因此，本专利技术创制了高蛋白合成、多碳源利用的野生毕赤酵母菌株，未来将多种低值物料开发为单细胞蛋白方面具有应用前景。
附图说明
[0015]图1：库德里阿威兹毕赤酵母Kud
‑
A在不同糖源培养情况。
[0016]图2：库德里阿威兹毕赤酵母Kud
‑
A在不同甲醇浓度下生长情况。
[0017]图3：库德里阿威兹毕赤酵母Kud
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A有两套完整的遗传背景。
[0018]图4：库德里阿威兹毕赤酵母Kud
‑
A单细胞蛋白氨基酸组成分析。
[0019]生物材料保藏信息
[0020]本专利技术的Kud
‑
A菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为：CGMCC NO. 26899，保藏时间为：2023年2月24日。其分类命名为库德里阿威兹毕赤酵母Pichia kudravzevii。
具体实施方式
[0021]下面通过具体实施例对本专利技术做进一步的阐述，以期更好的理解本专利技术，但不构成对本专利技术的限制。
实施例1
[0022]本专利技术通过筛选分离白酒糟放入盛有95 mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于
30℃、180 rpm振荡30 min。取菌悬液1 mL进行10
‑1ꢀ‑
10
‑
7 系列浓度梯度稀释，然后取10
‑5、10
ꢀ‑6、10
‑7三个稀释度涂布至以甲醇为唯一碳源的培养基平板上，于30℃倒置培养5d。
[0023]纯化：菌落在以甲醇为唯一碳源的培养基平板形成后，挑取单菌落于1.5%甲醇为唯一碳源的96孔板，30℃，180rpm培养2d，测定OD600nm。最终筛选甲醇为唯一碳源中生长最快的一株酵母菌，将获得菌落4℃保存。
[0024]该筛选获得菌株，经过一对通过ITS引物...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多碳源利用且高蛋白合成的毕赤酵母，其特征在于，其是库德里阿威兹毕赤酵母（Pichia kudravzevii），其保藏号为：CGMCC NO. 26899。2.如权利要求1所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，在含有氮源和碳源的培养基中进行有氧发酵培养。3.如权利要求2所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，以甲醇、甘油、乳糖、蔗糖、果糖或阿拉伯糖为唯一碳源进行培养。4.如权利要求2所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，培养温度不超45℃。5.如权利要求4所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，培养温度为35
‑
39℃。6.如权利要求3所述的毕赤酵母的培养方法，其特征在于，当以甲醇为唯一碳源时，甲醇浓度不超过3.5%（v/v）。7.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴信，高乐，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：