非特异性过氧合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种非特异性过氧合酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列为在非特异性过氧合酶rCviUPO的氨基酸构成发生R10K和R36K的位点突变、或发生R33K和R36K的位点突变。本发明专利技术的非特异性过氧合酶rCviUPO突变体rCviUPO

【技术实现步骤摘要】
非特异性过氧合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体地说，本专利技术涉及一种双氧水耐受的非特异性过氧合酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]非特异性过氧合酶(Unspecific peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1)是具有高生物技术应用价值的真菌血红素氧化酶(Heme
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thiolate peroxidase，HTP)亚家族的一员。
[0003]目前研究发现，UPO主要存在于双核菌亚界(Dikarya)和高等真菌界的子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)中，其催化中心结构与单加氧酶P450相似，且催化过程中不需要添加辅酶因子，仅需利用H2O2作为氧供体，且副产物为H2O，不仅可以实现芳香化合物的羟基化、含有C＝C键化合物的环氧化和硫醚类物质磺化等芳香化合物的氧化，还可以高效催化脂肪酸进行羟基化反应，作为一类潜在的工业用酶，其在食品原料加工、医药行业、环境治理等领域应用潜力巨大。
[0004]非特异性过氧合酶催化过程仅需利用H2O2作为氧供体，但是当酶遇到过量的H2O2时，大多数含血红素氧化还原酶活力受到抑制甚至失活，造成生产成本的增加，限制了应用范围，不利于产业化。在双氧水环境下维持较高的非特异性过氧合酶酶活性是实际生物催化过程中的难题。
[0005]因此，开发双氧水耐受的非特异性过氧合酶在理论和工业应用上具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于提供一种双氧水耐受的非特异性过氧合酶突变体及其应用。
[0007]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种非特异性过氧合酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为在非特异性过氧合酶rCviUPO的氨基酸构成发生R10K和R36K的位点突变、或发生R33K和R36K的位点突变。
[0009]本专利技术的第二方面，提供了上述非特异性过氧合酶突变体的编码基因。
[0010]本专利技术的第三方面，提供了一种插入有上述非特异性过氧合酶突变体的编码基因的重组表达载体。
[0011]本专利技术的第四方面，提供了一种表达上述重组表达载体的重组工程菌。
[0012]本专利技术的第五方面，提供了上述非特异性过氧合酶突变体、编码基因、重组表达载体、或重组工程菌在生物催化反应中的应用。
[0013]本专利技术的第六方面，提供了一种构建所述重组工程菌的方法，包括以下步骤：将上述非特异性过氧合酶突变体的编码基因克隆到表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，即得。
[0014]在本专利技术中，通过对非特异性过氧合酶rCviUPO进行定点突变后发现，突变体rCviUPO
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R10K
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R36K和rCviUPO
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R33K
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R36K，对双氧水的耐受性增强，在5mM双氧水中孵育6h，半衰期为野生型的2～3倍，在50mM的双氧水中处理2h，其半衰期仍为野生型的2～3倍，且相对于野生型，其酶活性更好。因此，本专利技术的非特异性过氧合酶突变体可在生物催化过程中应用，具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长和提高催化效率，更适用于工业领域上的应用。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例2中非特异性过氧合酶rCviUPO及其突变体纯化后的SDS
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PAGE电泳结果；其中M：marker；1：rCviUPO野生型；2：突变体rCviUPO
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R10K
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R36K；3：突变体rCviUPO
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R84K
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R96K；4：突变体rCviUPO
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R33K
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R36K。
[0016]图2为本专利技术实施例3中各突变体在不同浓度双氧水处理下相对酶活力的比较。
[0017]图3为本专利技术实施例3中各突变体在不同浓度双氧水中的耐受能力对比；其中，A为在5mM H2O2孵育；B为在10mM H2O2孵育；C为在20mM H2O2孵育；D为在50mM H2O2孵育。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0020]在本专利技术中，分析非特异性过氧合酶rCviUPO(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的酶结构氨基酸组成，发现氨基酸序列中精氨酸的数量占大多数，且在不同区域都存在，考虑将处于非催化loop区域还原性强的精氨酸Arg替换为还原性弱的赖氨酸Lys，并做叠加突变，起到增强整个酶的稳定性，从而间接降低双氧水对酶的失活作用，因此设计突变体rCviUPO
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R10K
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R36K(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，rCviUPO
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R33K
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R36K(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，rCviUPO
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R84K
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R96K(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。再构建得到高效表达该突变体的大肠杆菌工程菌。本专利技术中得到的非特异性过氧合酶突变体rCviUPO
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R10K
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R36K和rCviUPO
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R33K
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R36K，对双氧水的耐受性增强——rCviUPO
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R33K
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R36K在5mM双氧水中孵育6h，半衰期为野生型的2倍，在50mM的双氧水中处理2h，其半衰期仍为野生型的2倍，且相对于野生型，其酶活性更好；rCviUPO
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R10K
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R36K在5mM双氧水中孵育6h，半衰期为野生型的3倍，在50mM的双氧水中处理2h，其半衰期仍为野生型的3倍，且相对于野生型，其酶活性更好。本专利技术的非特异性过氧合酶突变体可在生物催化过程中应用，具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长和提高催化效率，更适用于工业领域上的应用。
[0021]非特异性过氧合酶rCviUPO的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
[0022]ELDFSKWKTRQPGEFRAPCPAMNSLANHGFIPR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非特异性过氧合酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为在非特异性过氧合酶rCviUPO的氨基酸构成发生R10K和R36K的位点突变、或发生R33K和R36K的位点突变。2.根据权利要求1所述的非特异性过氧合酶突变体，其特征在于，所述非特异性过氧合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.5所示。3.根据权利要求2所述的非特异性过氧合酶突变体，其特征在于，所述非特异性过氧合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种权利要求1所述的非特异性过氧合酶突变体的编码基因。5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永华，李田田，蓝东明，王方华，靳若尘，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：