一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌制造技术

本发明专利技术公开了一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌，包括如下步骤，制备培育人非小细胞肺癌细胞系(A549)：肺癌细胞培养的操作，把A549细胞的传代无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液，本发明专利技术专利采用无血清培养液(GT

【技术实现步骤摘要】
一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌


[0001]本专利技术涉及非小细胞肺癌治疗
，具体为一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌。

技术介绍

[0002]非小细胞肺癌是起源于支气管黏膜、支气管腺体和肺泡上皮的一类肺恶性肿瘤，显微镜下特点是核异形、细胞较大、胞浆丰富。
[0003]目前，肺癌的发病率和死亡率都位居癌症排行榜首位，由于早期肺癌病情隐匿，不易发现，而临床中发现80％的肺癌已属中晚期；对于非小细胞肺癌的主要的治疗手段有手术、化疗、放疗、分子靶向治疗、中医中药治疗和局部介入治疗。上述对于非小细胞肺癌的治疗方式，对于患者的身体伤害大，且治疗过程，会损伤人体本身的抗癌细胞，NK细胞和T细胞，对于非小细胞肺癌患者的治疗效果并不好，因此，如何提高人体抗癌细胞NK细胞和T细胞在人体内对癌细胞的杀死效率是目前急需解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌，解决了目前非小细胞治疗方式对患者身体伤害大的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌，包括以下步骤：
[0006]步骤1：制备培育人非小细胞肺癌细胞系(A549)：肺癌细胞培养的操作，把A549细胞的传代无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液；
[0007]向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清；
[0008]加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～8min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化；
[0009]加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞；
[0010]吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到；
[0011]吸取一半的细胞悬液，接种到新的接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10％～20％的胎牛血清；
[0012]倒置显微镜下观察，37℃、5％CO2培养；
[0013]步骤2：纯化富集人非小细胞肺癌细胞系：胰酶消化培养的细胞，1000
‑
2000rpm离心10
‑
15分钟收集细胞于离心管的底部；
[0014]用移液器吸走上清，加入2
‑
5倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水洗涤沉淀，1000
‑
2000rpm离心10
‑
15分钟收集细胞；
[0015]加入2
‑
5倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水洗涤沉淀，1000
‑
2000rpm离心10
‑
15
分钟收集细胞；
[0016]向沉淀中加入1倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水，稀释沉淀后，置于
‑
80℃冰箱或干冰中速冻10分钟，然后置于37℃水中溶解；然后再于
‑
80℃冰箱或干冰中速冻10分钟；如此往复8次；
[0017]10000rpm离心15分钟，把上清液转入干净无菌的离心管中，放于4℃保存；
[0018]向沉淀中加入1倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水，稀释沉淀后，置于
‑
80℃冰箱或干冰中速冻10分钟，然后置于37℃水中溶解；然后再于
‑
80℃冰箱或干冰中速冻10分钟；如此往复8次；
[0019]10000rpm离心15分钟，把上清液转入干净无菌的离心管中，放于4℃保存；
[0020]把第一次的液体和第二次的液体混合到一起，混匀后标记(nsclc AG)保存；
[0021]步骤3：获取树突状细胞：采集获取血液50ml分别置于2支50ml离心管中，1500r/min离心5min后，把黄色上清液倒入新的50ml离心管中离心灭活备用，剩下的合并到一支离心管中并加入生理盐水至25ml混匀；
[0022]另取一支50ml离心管，加入25ml细胞分离液，用无菌吸管小心的将上述血细胞悬液沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液的表面，使两者之间形成清晰的界面；
[0023]1500r/min，离心10min后，用滴管轻轻插到白膜层，吸出该层细胞移入另外的离心管里，加生理盐水至45ml，混匀，1500r/min，离心5min弃上清，将底部细胞混匀，再加入生理盐水，按照1500r/min，离心5min离心洗涤两次，最后一次离心结束后，弃上清，用手轻柔的晃动离心管，把细胞晃匀，用无血清培养液(GT
‑
T551,TaKaRa)将离心管中的细胞重悬，根据回输安排把所有细胞平均分配到3瓶的75cm2培养瓶中，每瓶中培养液的量为25ml，放入培养箱中进行培养；
[0024]2h后，取出培养瓶，将每瓶内悬浮细胞液分别转移到离心管中，再向3瓶75cm2培养瓶内加入25ml DC细胞培养液，和37.5ul H1因子，置于培养箱中以DC(贴壁)细胞培养，当天记为第0天；
[0025]培养第5天，向所有DC细胞培养瓶中加入50ul nsclc AG,放入培养箱中进行培养；
[0026]培养第7天，把所有的DC细胞悬液收集起来，使用流式细胞术检测细胞表面分子标志(MHC
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I、MHC
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2、CD80、CD86、CD40、CD40L)，来验证所培养的细胞是否具有树突状细胞的表型；
[0027]检测发现树突状细胞高表达MHC
‑
I、MHC
‑
2、CD80、CD86、CD40、CD40L，由此可见培养的细胞为树突状细胞。
[0028]优选的，在步骤1中，每瓶液体量为5～10ml。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0030]本专利技术专利采用无血清培养液(GT
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T551,TaKaRa)将离心管中的细胞重悬，通过DC细胞培养液和37.5ul H1因子进行培养，并在之后的第五天向所有DC细胞培养瓶中加入50ul nsclc AG，培养得出树突状细胞，以培养获得的树突状细胞作为疫苗对患者进行注射，通过树突状细胞促进人体抗癌细胞NK细胞和T细胞活化，激发更多的T细胞和NK细胞的生成，让NK细胞和T细胞对于癌细胞的杀死效率提高，从而达到对非小细胞肺癌治疗的效果。
具体实施方式
[0031]下面将通过实施例的方式对本专利技术作更详细的描述，这些实施例仅是举例说明性的而没有任何对本专利技术范围的限制。
[0032]本专利技术提供一种技术方案：一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌，包括以下步骤：
[0033]步骤1：制备培育人非小细胞肺癌细胞系(A549)：肺癌细胞培养的操作，把A549细胞的传代无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液；
[0034]向已本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于个性化修饰树突状细胞治疗非小细胞肺癌，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：制备培育人非小细胞肺癌细胞系(A549)：肺癌细胞培养的操作，把A549细胞的传代无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液；向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清；加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～8min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化；加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞；吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到；吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10％～20％的胎牛血清；倒置显微镜下观察，37℃、5％CO2培养；步骤2：纯化富集人非小细胞肺癌细胞系：胰酶消化培养的细胞，1000
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2000rpm离心10
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15分钟收集细胞于离心管的底部；用移液器吸走上清，加入2
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5倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水洗涤沉淀，1000
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2000rpm离心10
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15分钟收集细胞；加入2
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5倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水洗涤沉淀，1000
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2000rpm离心10
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15分钟收集细胞；向沉淀中加入1倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水，稀释沉淀后，置于
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80℃冰箱或干冰中速冻10分钟，然后置于37℃水中溶解；然后再于
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80℃冰箱或干冰中速冻10分钟；如此往复8次；10000rpm离心15分钟，把上清液转入干净无菌的离心管中，放于4℃保存；向沉淀中加入1倍体积的灭菌PBS缓冲液或生理盐水，稀释沉淀后，置于
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80℃冰箱或干冰中速冻10分钟，然后置于37℃水中溶解；然后再于
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80℃冰箱或干冰中速冻10分钟；如...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶源溪，李丁，吕贯廷，
申请(专利权)人：深圳市俊元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：