一种糖基转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域、食品添加剂领域，具体涉及一种催化活性以及稳定性提升的鼠李糖基转移酶突变体及其应用。具体通过定点突变技术，提高了鼠李糖基转移酶C12RT的热稳定性以及对橙皮素

【技术实现步骤摘要】
一种糖基转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
、食品添加剂领域，具体涉及一种催化活性以及稳定性提升的鼠李糖基转移酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]新橙皮苷(Neohesperidin)是一种二氢黄酮类化合物，存在于芸香科和茜草科植物中(于宏伟,张绍岩,陆敏,等.新橙皮苷研究进展[J].河南农业科学,2011(08):33
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35.)。该化合物具有多种生物活性，如清除自由基、抗过敏、抗癌、降血脂、保护神经系统等，同时也是合成重要低热量甜味剂新橙皮苷二氢查耳酮(Neohesperidin Dihydrochalcone，甜度为蔗糖的2000倍)的关键中间体(Manthey J A,Grohmann K,Guthrie N.Biological properties of citrus flavonoids pertaining to cancer and inflammation.[J].Current medicinal chemistry,2001(2):8；[1]Lindley M G,Beyts P K,Canales I,et al.Flavor Modifying Characteristics of the Intense Sweetener Neohesperidin Dihydrochalcone[J].Journal of Food Science,2010,58(3):592
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594.)。因其重要的生理功能，新橙皮苷在生物医药、食品和动物饲料行业被广泛使用。
[0003]研究报道的新橙皮苷的制备主要有三种方式：1、植物提取，主要从芸香科植物如酸橙、甜橙、枳实、枳壳以及茜草科植物(毛钩藤)等植物中提取，是制备新橙皮苷的最主要方法，但天然植物中新橙皮苷的含量低，提取率低；2、化学法合成，利用原料易得的柚皮苷进行转化，但过程中涉及酸碱等催化剂；3、生物转化，以来源丰富的橙皮苷为原料，利用糖苷水解酶和糖基转移酶生物合成制备新橙皮苷，该方法具有重要的经济价值，但距离工业化生产还存在许多问题亟待解决(于宏伟,张绍岩,陆敏,等.新橙皮苷研究进展[J].河南农业科学,2011(08):33
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35.)。
[0004]针对生物法合成新橙皮苷中的鼠李糖基转移酶催化活性差、稳定性不足等问题，本专利提供了一系列酶稳定性提升同时具有较好催化活性的鼠李糖基转移酶突变体，并构建了由橙皮苷合成新橙皮苷的全生物合成路线。涉及到的过程为：糖苷水解酶催化橙皮苷专一性生成中间产物橙皮素
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葡萄糖，随后鼠李糖基转移酶催化该中间产物生成新橙皮苷。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过定点突变技术，提高了鼠李糖基转移酶C12RT的热稳定性以及对橙皮素
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葡萄糖的催化活性；并构建了新橙皮苷的生物转化方法，成功实现了转化橙皮苷合成新橙皮苷，弥补了目前生物法合成新橙皮苷存在的不足。
[0006]因此，本专利技术首先提供一种糖基转移酶突变体，其相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在下述一个或多个位点突变：K35N、K35F、Q49S、Q49T、N58Y、N58D、N58K、Q69H、Q69Y、Q69P、S79P、S79H、Q80D、Q80E、Q80S、D135N、S168D、S168R、S168E、D172E、N179L、N179F、N179A、N179V、Y180Q、Y180N、S216A、S216Q、P223S、P223Q、P223K、F242D、F242H、
F242Y、K243Y、K243S、Q255K、Q255P、A314Q、A314K、A314E、Q327L、Q327A、Q327S、Y370N、Y370D、Y370S、S438D、S438Q、N423K、N423Q。
[0007]优选地，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在下述突变：Y370D/N423K、Y370D/P223Q、Y370D/N179A、Y370D/Q80E、Y370D/Q69P、Y370D/S79P、P223Q/S79P、P223Q/D172E、P223Q/Y180Q、P223Q/S216A、P223Q/Q255K、P223Q/A314L、P223Q/S438E、N179L/P223Q、N179L/K35R、N179L/Q48T、N179L/Q69Y、N179L/D135N、N179L/S168R、Q80E/Q327A、Q80E/Q255K、Q80E/N423K、Q80E/A314K、Q80E/A314L、Q80E/S438E；或者Y370D/N423K/Q255K、Y370D/N423K/A314E、Y370D/N423K/S438D、P223Q/S438E/K35R、P223Q/S438E/Q80E、P223Q/S438E/S216A、P223Q/S438E/N423K、N179L/Q48T/Y370D、N179L/Q48T/S438D、N179L/Q48T/K35R、Q80E/N423K/Y370D、Q80E/N423K/Q48T、Q80E/N423K/Q69H、Y370D/N423K/S438D/N179L、Y370D/N423K/S438D/Q80E、P223Q/S438E/S216A/K35R、P223Q/S438E/S216A/Q255K、N179L/Q48T/Y370D/N423K、Q80E/N423K/Y370D/Q48T、Y370D/N423K/S438D/N179L/Q48T、Y370D/N423K/S438D/N179L/N58Y、Y370D/N423K/S438D/N179L/Q80E、Y370D/N423K/S438D/N179L/S168R、Y370D/N423K/S438D/N179L/N179A、P223Q/S438E/S216A/Q255K/S79P、P223Q/S438E/S216A/Q255K/Q80E、P223Q/S438E/S216A/Q255K/D135G、P223Q/S438E/S216A/Q255K/D172E、P223Q/S438E/S216A/Q255K/Y180Q、P223Q/S438E/S216A/Q255K/A314L、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K、P223Q/S438E/S216A/Q255K/K35R、Q80E/N423K/Y370D/Q48T/Q255K、Q80E/N423K/Y370D/Q48T/Q327A、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K/K35R、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K/D135G、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K/D172E、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K/Y180Q、P223Q/S438E/S216A/Q255K/N423K/A31本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在下述一个或多个位点突变：K35N、K35F、Q49S、Q49T、N58Y、N58D、N58K、Q69H、Q69Y、Q69P、S79P、S79H、Q80D、Q80E、Q80S、D135N、S168D、S168R、S168E、D172E、N179L、N179F、N179A、N179V、Y180Q、Y180N、S216A、S216Q、P223S、P223Q、P223K、F242D、F242H、F242Y、K243Y、K243S、Q255K、Q255P、A314Q、A314K、A314E、Q327L、Q327A、Q327S、Y370N、Y370D、Y370S、S438D、S438Q、N423K、N423Q。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在下述突变：Y370D/N423K、Y370D/P223Q、Y370D/N179A、Y370D/Q80E、Y370D/Q69P、Y370D/S79P、P223Q/S79P、P223Q/D172E、P223Q/Y180Q、P223Q/S216A、P223Q/Q255K、P223Q/A314L、P223Q/S438E、N179L/P223Q、N179L/K35R、N179L/Q48T、N179L/Q69Y、N179L/D135N、N179L/S168R、Q80E/Q327A、Q80E/Q255K、Q80E/N423K、Q80E/A314K、Q80E/A314L、Q80E/S438E；或者Y370D/N423K/Q255K、Y370D/N423K/A314E、Y370D/N423K/S438D、P223Q/S438E/K35R、P223Q/S438E/Q80E、P223Q/S438E/S216A、P223Q/S438E/N423K、N179L/Q48T/Y370D、N179L/Q48T/S438D、N179L/Q48T/K35R、Q80E/N423K/Y370D、Q80E/N423K/Q48T、Q80E/N423K/Q69H、Y370D/N423K/S438D/N179L、Y370D/N423K/S438D/Q80E、P223Q/S438E/S216A/K35R、P223Q/S438E/S216A/Q255K、N179L/Q48T/Y370D/ N423K、Q80E/ N423K/Y370D/ Q48T、Y370D/N423K/S438D/N179L/Q48T、Y370D/N423K/S438D/N179L/N58Y、Y370D/N423K/S438D/N179L/Q80E、Y370D/N423K/S438D/N179L/S168R、Y370D/N423K/S438D/N179L/N179A、P223Q/S438E/S216A/Q255K/S79P、P223Q/S438E/S216A/Q255K/Q80E、P223Q/S438E/S216A/Q255K/D135G、P223Q/S438E/S216A/Q255K/D172E、P223Q/S438E/S216A/Q255K/Y180Q、P223Q/S438E/S216A/Q255...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娇，陈泰燕，杨建刚，陈朋，朱玥明，孙媛霞，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：