【技术实现步骤摘要】
培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法
[0001]本专利技术涉及一种培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，属于干细胞培养
技术介绍
[0002]呼吸道(respiratorytract)是人体直接对外界开放的器官之一，鼻腔气道上皮细胞作为呼吸道的门户是人体一道重要的生理防御屏障，在抵御病原微生物入侵及清除有毒物质等方面起着重要的作用。气道和呼吸肺泡源自原始内胚层的不同原基(buds)，即气管原基和肺原基，两个原基中含有不同的干细胞，分别称为近端(proximal)和远端(distal)干细胞。近端干细胞即是气道基底干细胞(Basal stem cells)，远端干细胞包括细支气管基底干细胞(Basal stem cells)、呼吸性细支气管与肺泡导管连接处(BADJ)的干细胞(bronchioalveolar stem cells，BASCs)以及肺泡Ⅱ型细胞。目前研究的共识是，沿着气道至肺分布着不同干细胞，他们具有区域性(region specific)，例如近端的气道干细胞不能分化成远端肺部的细胞，反之亦然，远端的干细...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，其特征在于：采用鼻刷刮取的方式，从鼻腔黏膜深处获取细胞，进行传代培养及干性验证；在鼻腔黏膜基底层上皮干细胞的融合度达到80％～90％时，对鼻腔黏膜基底层上皮干细胞进行传代或冻存。2.根据权利要求1所述的培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，其特征在于：从鼻腔黏膜深处获取细胞，进行传代培养的具体操作为：(1)刷取鼻腔黏膜基底层上皮干细胞之前，用100μl的LN 521(浓度5μg/ml)铺24孔板；(2)用生理盐水清洗鼻子3次；(3)鼻拭子伸入鼻甲区，旋转、前后刷取鼻腔黏膜基底层上皮干细胞；(4)折断鼻拭子放入装有3mL的IMDM(不含FBS，含2.5
×
Amphotericin B，Pen/Strep和庆大霉素20μg/ml)培养基的15mL离心管中；(5)涡旋剧烈摇晃30次；(6)用镊子取出拭子在管壁挤出多余液体，弃鼻拭子，1000rpm离心5min；(7)弃上清，用0.5ml的TrypLE
TM
Select酶消化2min，0.5ml的IMDM培养基(含10％FBS)终止，枪上下吹打10次，收集滤液；(8)用DPBS(含2.5
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Amphotericin B,Pen/Strep和庆大霉素20μg/ml)洗1次，1000rpm离心5min，弃上清；(9)将样本种到提前用LN 521铺板的孔板中，用PneumaCult
TM
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Ex Plus Medium培养基(含2.5
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Amphotericin B，Pen/Strep和庆大霉素20μg/ml)；(10)放入37℃培养箱中培养。3.根据权利要求1所述的培养鼻黏膜基底层上皮干细胞的方法，其特征在于，进行干性验证的具体操作为：(1)细胞培养：使用PneumaCultTM
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Ex Plus Medium培养基培养细胞，每两天换一次液，传代扩增培养，传至P2代时将细胞种于CELL SLIP中，细胞贴壁后进行细胞免疫荧光实验；(2)从培养箱中拿出细胞，用PBS洗3次，每次5min；(3)使用5ml 4％多聚甲醛固定15min；(4)弃去4％多聚甲醛，加5ml 0.5％Triton X
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100，通透15min；(5)弃去0.5％Triton X
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100，加5ml 5％山羊血清封闭液，封闭30min；(6)弃去封闭液，滴加一抗，保湿盒中4℃过夜孵育；所述一抗，包括SOX2抗体和SOX9抗体；SOX2抗体，反应种属：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用浓度1:1000；SOX9抗体，反应种属：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用浓度1:240；(7)吸弃一抗，DPBS洗3次，每次5min；(8)滴加二抗，避光，37℃，孵育1h；所述二抗，包括Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 488，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李琼琼，潘格，崔玉芹，温泉，张文华，张智慧，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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