具有隐窝-绒毛轴结构的人源肠类器官及其制备方法、应用技术

本申请涉及一种具有隐窝

【技术实现步骤摘要】
具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官及其制备方法、应用


[0001]本申请涉及细胞培养
，特别是涉及一种具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官的制备方法。

技术介绍

[0002]肠黏膜上皮是更新最快的组织之一，所有分化类型细胞的持续更迭始于内陷的隐窝基底部干细胞生态位，其异常将迅速引起肠屏障的破坏，导致肠道增生、炎症和癌症。肠上皮细胞的分布层次始于内陷的隐窝基部，这是主要的肠干细胞生态位。干细胞分裂形成的子细胞向外分化、成熟形成突出的绒毛，构成特征性的隐窝
‑
绒毛轴结构。上皮下主要起源于中胚层的一群异质的间充质细胞，包括上皮下成纤维细胞和肌成纤维细胞等，构成了紧邻肠道上皮的主要基质细胞群。
[0003]然而，肠上皮隐窝
‑
绒毛轴结构中内陷的隐窝基部的干细胞生态位异常是造成许多肠疾病发生的原因。因此，有良好的干细胞生态位结构的肠类器官模型在研究疾病发生机理中至关重要。例如，Notch信号通路参与了癌症生物学的许多方面，包括血管生成、肿瘤免疫和癌症干细胞样细胞的维持。在过去的20年里，已经开发了几种Notch靶向治疗策略，许多药物已经一些临床癌症试验中进行了评估。然而，这一治疗方案带来一系列副作用，特别是胃肠道系统的剂量限制毒性，导致的肠干细胞生态位的破坏和肠上皮干细胞分化异常，表现为肠粘膜受损和严重的分泌型腹泻，通常是肠上皮分泌型细胞，如潘氏细胞、杯状细胞和内分泌细胞大量增加导致。
[0004]但是，在目前的人源肠类器官构建方案中，人源肠类器官难以形成形态良好的典型隐窝
‑
绒毛轴的干细胞生态位结构。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请一方面提供一种能形成具有良好隐窝干细胞生态位结构的人源肠类器官的制备方法，具体方案如下：
[0006]提供人多能干细胞诱导分化形成的肠类器官；
[0007]将所述肠类器官置于气液相界面进行培养，制备所述具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官；
[0008]所述气液相界面中的液相为重组胶原基质，所述重组胶原基质包括细胞培养用胶原和DMEM/F
‑
12培养基，且所述细胞培养用胶原与所述DMEM/F
‑
12培养基的体积比为(7～8)：(2～3)，所述DMEM/F
‑
12培养基中含有0.1μmol/L～1μmol/L的WNT激动剂。
[0009]在其中一些实施例中，所述WNT激动剂包括CHIR99021及WNT3A中的至少一种。
[0010]在其中一些实施例中，所述DMEM/F
‑
12培养基还包括1～2
×
B27、1～2
×
N2、80ng/mL～120ng/mL表皮生长因子、0.1mmol/L～5mmol/L L
‑
谷氨酰胺、10mmol/L～20mmol/L HEPES缓冲液。
[0011]在其中一些实施例中，将所述肠类器官置于气液相界面进行培养的步骤，包括如
下步骤：
[0012]在细胞培养小室的内皿中加入400μL～1000μL所述重组胶原基质，凝固后，在外孔中加入所述DMEM/F
‑
12培养基使得液面低于所述重组胶原基质包备的细胞培养小室的上表面；
[0013]再将所述肠类器官放置在所述重组胶原基质上进行培养。
[0014]在其中一些实施例中，所述人多能干细胞诱导分化的肠类器官的制备方法包括以下步骤：
[0015]步骤S10：将人多能干细胞诱导分化形成限制性内胚层；
[0016]步骤S20：将所述限制性内胚层诱导分化形成中后肠球；
[0017]步骤S30：将所述中后肠球诱导分化形成肠类器官。
[0018]在其中一些实施例中，所述细胞培养用胶原选自Cellmatrix I
‑
A型胶原蛋白。
[0019]在其中一些实施例中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞和/或人诱导多能干细胞。
[0020]本申请另一方面提供一种具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官，根据上述的制备方法制备得到。
[0021]本申请还提供一种药物性肠病类器官模型的制备方法，包括以下步骤：
[0022]提供上述的具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官；
[0023]将所述具有隐窝
‑
绒毛轴结构的人源肠类器官在含有γ
‑
分泌酶抑制剂的培养基中进行培养。
[0024]本申请还提供一种药物性肠病类器官模型，根据上述的制备方法制备得到。
[0025]通过调控特定细胞培养用胶原和DMEM/F
‑
12培养基的特定配比，将多能干细胞诱导分化的肠类器官置于气液相界面进行培养，从而获得具有良好隐窝干细胞生态位结构的人源肠类器官，在此基础上，可用于形成模拟Notch靶向治疗导致的药物性肠病模型，筛选或鉴定用于治疗药物性肠病的药物。
附图说明
[0026]图1为实施例1中hESCs向具有绒毛
‑
隐窝轴结构的肠类器官分化的阶段示意图；
[0027]图2为实施例1中WNT激动剂对类器官隐窝
‑
绒毛轴结构的生长影响，黑框内显示类隐窝
‑
绒毛轴结构，黑色剪头显示上皮分化异常；
[0028]图3为实施例1中气液相交界培养条件下人源类器官显微观察图；
[0029]图4为实施例1中气液相培养条件下激光共聚焦显微图；
[0030]图5为实施例1中DAPT导致的药物性肠病类器官激光共聚焦显微图；
[0031]图6为对比例1中成体肠干细胞来源的肠类器官。
具体实施方式
[0032]为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。
[0033]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的
技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。在本文中“可选地”表示举例。
[0034]术语
[0035]WNT激动剂，被定义为激活细胞中TCF/LEF介导的转录的试剂。
[0036]表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。
[0037]成纤维细胞生长因子FGF(Fibroblast Growth Factors，FGFs)是由约150
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200氨基酸组成的多肽，作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。
[0038]类器官是指原代组织提取出来的成体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有隐窝
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绒毛轴结构的人源肠类器官的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提供人多能干细胞诱导分化形成的肠类器官；将所述肠类器官置于气液相界面进行培养，制备所述具有隐窝
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绒毛轴结构的人源肠类器官；所述气液相界面中的液相为重组胶原基质，所述重组胶原基质包括细胞培养用胶原和DMEM/F
‑
12培养基，且所述细胞培养用胶原与所述DMEM/F
‑
12培养基的体积比为(7～8)：(2～3)，所述DMEM/F
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12培养基中含有0.1μmol/L～1μmol/L的WNT激动剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述WNT激动剂包括CHIR99021及WNT3A中的至少一种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DMEM/F
‑
12培养基还包括1～2
×
B27、1～2
×
N2、80ng/mL～120ng/mL表皮生长因子、0.1mmol/L～5mmol/L L
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谷氨酰胺、10mmol/L～20mmol/L HEPES缓冲液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述肠类器官置于气液相界面进行培养的步骤，包括如下步骤：在细胞培养小室的内皿中加入4...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾思聪，李进，戴聪伶，何彩霞，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：