用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法技术

本发明专利技术提供了用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法。所述方法包括以下步骤：细胞复苏，细胞种子扩增，N

【技术实现步骤摘要】
用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种用于规模化生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法。

技术介绍

[0002]受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是一种跨膜受体酪氨酸激酶蛋白，人源ROR1由一个胞外的免疫球蛋白样结构域(Ig)、两个富含半胱氨酸的结构域(FZD)、近膜kringle结构域、单次跨膜结构以及一个胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)、两个丝/苏氨酸富集结构域(S/TRD)和一个脯氨酸富集结构域(PRD)组成。通过介导多种信号通路的信号传递，调节细胞分裂、增殖、迁移和细胞趋化。ROR1在人正常组织中低表达或不表达，但是在多种血液瘤及实体瘤中高度表达。高表达ROR1的血液瘤包括B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和髓系血液癌症。在实体瘤中，表达ROR1的肿瘤包括三阴性乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等，并且ROR1的表达情况还与疾病的进展以及治疗效果密切相关。因此ROR1可作为一种特异性的肿瘤标志物以及肿瘤治疗的一个潜在有吸引力的靶点。
[0003]上游的细胞培养工艺是支持提升最终产品一致性及质量，同时保证更高的效价或更大的收获量的重要步骤。在投入大规模生产前，从最基本的培养基配方的优化，初期的细胞复苏传代参数的控制，到细胞培养工艺放大的规模化，上游细胞培养工艺的每一步变化和调整都成倍增加了上游工艺的失败几率。
[0004]动物细胞是无细胞壁的真核细胞，由于其生长缓慢，对培养环境非常敏感，故在采用传统生化技术对其进行大规模培养时，不仅需要满足培养过程所需的营养供给，同时还需建立合理的控制模式，最优化pH和溶氧(DO)参数。选择合适的细胞生物反应器设计动物细胞培养罐的空气、氧气、氮和二氧化碳的流量等参数使得气体能够有序、定量地控制，保持细胞生长最佳比例，以持续控制细胞培养液中pH值和溶解氧水平，这是所有实验致力于开发的重点。由于生物工艺本质上是可变性的，故过程开发必须确保在严格的时间范围内，有能力提供稳定一致的工艺和可靠的活性成分，同时最好给出相对成熟的验证工艺的可变性范围。
[0005]在生物制药上游工艺过程中，细胞培养规模化、安全化生产是业内普遍关注的核心问题。上游工艺的开发有诸多考虑因素，了解关键因素并应用DoE进行实验方法摸索和工艺设计，利用细胞培养放大的理念，选择和设计不同阶段使用的细胞反应器，可以保证生产工艺的有效放大和产品的安全稳定；利用过程监测与控制技术可以使培养系统保持在最佳的状态，这是整个工艺中极为重要的一环。

技术实现思路

[0006]基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法，可以满足细胞生长所需营养，且稳定培养基的pH和溶氧。通过本专利技术的方法可
以得到高回收率的目标产物，且最终产物的一致性较高，可以用于商业化生产。
[0007]本专利技术提出的ROR1单克隆抗体的细胞培养方法，包括培养基配方，细胞复苏及扩增工艺规定，细胞培养放大的工艺规定。
[0008]因此，本专利技术提供了一种用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法，包括以下步骤：
[0009]S1，细胞复苏：将表达抗人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的人源化单克隆抗体的细胞株水浴融化后使用基础培养基1进行培养，其中，所述基础培养基1配方如下：CHO细胞Growth A生长培养基(BalanCD_CHO_GrowthA)23.72g/L，NaHCO
3 2.20g/L，L
‑
谷氨酰胺0.73g/L，超纯水定容，pH 6.80～7.20；
[0010]S2，细胞种子传代扩增：包括使用所述基础培养基1培养S1得到的细胞的步骤，进行该步骤扩增以期使得活细胞密度达到(2.00～6.00)
×
106细胞/ml，且活率≥90.00％；
[0011]S3，波浪式反应器种子扩增：包括使用所述基础培养基1培养S2得到的细胞的步骤，其中，补加基础培养基2扩增培养体积，其中，所述基础培养基2配方如下：GrowthA 118.96g/L，L
‑
谷氨酰胺0.73g/L，NaHCO
3 2.20g/L，Glycosylation Adjust(GAL+)10ml/L，超纯水定容，pH 6.80～7.20；
[0012]S4，生产规模培养：包括使用所述基础培养基2培养S3得到的细胞的步骤，在该步骤中，通过补加补料培养基3保证细胞所需营养并将葡萄糖浓度维持在2.0～8.0g/L的范围内，其中，所述补料培养基3配方如下：CHO细胞补料培养基Feed4(BalanCD CHO Feed 4)67.31g/L，葡萄糖40.00g/L，NaHCO
3 2.20g/L，Glycosylation Adjust(GAL+)22.22ml/L，超纯水定容，pH7.00～7.60；
[0013]S5，收获发酵物。
[0014]本专利技术方法中，优选地，S1中，在温度36.5℃，CO2浓度5.0％，摇床转速120rpm条件下培养所述细胞。
[0015]在本专利技术方法的一个实施方式中，S2包括以下步骤：
[0016]S2
‑
1，N
‑
5种子扩增：使用所述基础培养基1培养S1得到的细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.20～0.40)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(0.80～2.00)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；
[0017]S2
‑
2，N
‑
4种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
5种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；
[0018]S2
‑
3，N
‑
3种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
4种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；
[0019]S2
‑
4，N
‑
2种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
3种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(2.00～6.00)
×
106细胞/ml时，传代至下一级。
[0020]在本专利技术方法的一个实施方式中，S3包括以下步骤：
[0021]S3
‑
1，预培养：在反应器中使用所述基础培养基1进行预培养1～2天后，取样显微镜检测确认无杂菌生长；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法，包括以下步骤：S1，细胞复苏：将表达抗人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的人源化单克隆抗体的细胞株水浴融化后使用基础培养基1进行培养，其中，所述基础培养基1配方如下：CHO细胞Growth A生长培养基(BalanCD_CHO_GrowthA)23.72g/L，NaHCO
3 2.20g/L，L
‑
谷氨酰胺0.73g/L，超纯水定容，pH 6.80～7.20；S2，细胞种子传代扩增：包括使用所述基础培养基1培养S1得到的细胞的步骤，进行该步骤扩增以期使得活细胞密度达到(2.00～6.00)
×
106细胞/ml，且活率≥90.00％；S3，波浪式反应器种子扩增：包括使用所述基础培养基1培养S2得到的细胞的步骤，在该步骤中，通过补加基础培养基2扩增培养体积，其中，所述基础培养基2配方如下：GrowthA 118.96g/L，L
‑
谷氨酰胺0.73g/L，NaHCO
3 2.20g/L，Glycosylation Adjust(GAL+)10ml/L，超纯水定容，pH6.80～7.20；S4，生产规模培养：包括使用所述基础培养基2培养S3得到的细胞的步骤，在该步骤中，通过补加补料培养基3保证细胞所需营养并将葡萄糖浓度维持在2.0～8.0g/L的范围内，其中，所述补料培养基3配方如下：CHO细胞补料培养基Feed4(BalanCD CHO Feed 4)67.31g/L，葡萄糖40.00g/L，NaHCO
3 2.20g/L，Glycosylation Adjust(GAL+)22.22ml/L，超纯水定容，pH7.00～7.60；S5，收获发酵物。2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其中，S1中，在温度36.5℃，CO2浓度5.0％，摇床转速120rpm条件下培养所述细胞；和/或其中，S2包括以下步骤：S2
‑
1，N
‑
5种子扩增：使用所述基础培养基1培养S1得到的细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.20～0.40)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(0.80～2.00)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；S2
‑
2，N
‑
4种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
5种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；S2
‑
3，N
‑
3种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
4种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；S2
‑
4，N
‑
2种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
3种子细胞，其中，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，当活细胞密度达到(2.00～6.00)
×
106细胞/ml时，传代至下一级；和/或其中，S3包括以下步骤：S3
‑
1，预培养：在反应器中使用所述基础培养基1进行预培养1～2天后，取样显微镜检测确认无杂菌生长；S3
‑
2，N
‑
1细胞扩增：使用S3
‑
1中预培养的培养基培养N
‑
2种子，当活细胞密度达到(2.00～6.00)
×
106细胞/mL时，传代至下一级；S3
‑
3，第一次补加培养基：N
‑
1种子培养达到扩增标准(2.00～4.00)
×
106细胞/mL后，补加基础培养基2扩增培养体积；
S3
‑
4，第二次补加培养基：N
‑
1种子培养达到扩增标准(2.00～4.00)
×
106细胞/mL后，补加所述基础培养基2扩增培养体积；S3
‑
5，第三次补加培养基：N
‑
1种子培养达到扩增标准(2.00～4.00)
×
106细胞/mL后，补加所述基础培养基2扩增培养体积；S3
‑
6，第四次补加培养基：N
‑
1种子培养达到扩增标准(2.00～4.00)
×
106细胞/mL后，补加所述基础培养基2扩增培养体积；S3
‑
7，移种，其中，N
‑
1种子细胞密度低于标准(3.00～6.00)
×
106细胞/mL，则继续培养，达到标准则用倒置显微镜检查样品，确认无菌后进行下一步操作，将细胞种子接种至生产规模培养；和/或其中，S4包括以下步骤：S4
‑
1，预培养：在反应器中使用所述基础培养基2预培养12小时后，取样校正pH为7.10
±
0.20；S4
‑
2，接种并培养：确认反应器参数变化的曲线波动正常后，将当前DO校正为100％，在60min内将种子液接种到反应器中进行培养，其中，通过补加补料培养基3保证细胞所需营养并将葡萄糖浓度维持在2.0～8.0g/L的范围内；和/或其中，在S5步骤中，当培养周期14天或细胞活率低于60.00％时，结束培养，并收获。3.一种用于生产ROR1单克隆抗体的细胞培养方法，包括以下步骤：S1，细胞复苏：将表达抗人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的人源化单克隆抗体的细胞株冻存管自液氮罐取出后，放置在
‑
80℃温度下不超过90min，然后在37.5
±
1℃水浴温度下水浴加热120～150s，使用基础培养基1将融化后的细胞洗涤后，在温度36.5℃，CO2浓度5.0％，摇床转速120rpm条件下培养，其中，所述基础培养基1配方如下：CHO细胞Growth A生长培养基(BalanCD_CHO_GrowthA)23.72g/L，NaHCO
3 2.20g/L，L
‑
谷氨酰胺0.73g/L，超纯水定容，pH 6.80～7.20，过滤除菌；S2，细胞种子扩增：包括以下步骤：S2
‑
1，N
‑
5种子扩增：使用所述基础培养基1培养S1得到的细胞，其中，目标接种密度：0.30
×
106细胞/ml，接种后活细胞密度：(0.20～0.40)
×
106细胞/ml，活率≥85.00％，当活细胞密度达到(0.80～2.00)
×
106细胞/ml，且活率≥85.00％时，传代至下一级；S2
‑
2，N
‑
4种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
5种子细胞，其中，目标接种密度：0.40
×
106细胞/ml，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，活率≥85.00％，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml，且活率≥85.00％时，传代至下一级；S2
‑
3，N
‑
3种子扩增：使用所述基础培养基1培养N
‑
4种子细胞，其中，目标接种密度：0.40
×
106细胞/ml，接种后活细胞密度：(0.30～0.50)
×
106细胞/ml，活率≥85.00％，当活细胞密度达到(1.50～3.50)
×
106细胞/ml，且活率≥85.00％时，传代至下一级；S2<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴光昊，柯樱，刘煜，高燕波，徐章荻，郑昆，徐翀颿，
申请(专利权)人：上海上药交联医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：