一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用，属于基因检测领域。该提取方法包括：采集唾液样本，用LPKS法提取唾液样本基因组DNA，即在唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA。本发明专利技术建立一种高效、简易、环保且低成本的唾液细菌基因组DNA提取方法，用LPKS法提取唾液细菌基因组DNA的浓度和质量能够满足宏基因组测序和定量PCR检测的要求，具有很高的推广应用价值，有助于更广泛地开展口腔致病菌相关的临床研究及检测。菌相关的临床研究及检测。菌相关的临床研究及检测。

【技术实现步骤摘要】
一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种唾液细菌基因组DNA的提取方法和应用。

技术介绍

[0002]口腔中定植有大量的微生物，当口腔微生物群落与宿主间生态关系失衡时可诱发多种口腔及全身系统性疾病。口腔微生物群多以生物膜形式定植在各生态区行使功能，附着在膜表面上的菌群会持续脱落到唾液中，而唾液中的微生物又不断在各个生态区定植。因此，唾液微生物群可作为口腔微生物群的“指纹”，唾液是一个潜在的巨大生物标志物储存库。此外，唾液来源丰富，采集过程具有无创无痛、方便快捷、无血源性疾病传播等优势，是理想的生物学样本。
[0003]唾液细菌基因/基因组检测在疾病风险评估和辅助诊断方面已有很多研究，相关结果具有非常重要的潜在应用价值，而建立高效、低成本的唾液细菌基因组DNA提取方法是开展大规模口腔致病菌相关临床研究与检测的前提。综合文献分析，目前细菌基因组DNA提取方法主要包括：试剂盒抽提法、酚
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氯仿抽提法、冰冻
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煮沸法及Chelex
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100抽提法等，其中试剂盒抽提法是国内外研究普遍应用的方法，具有提取效率高、质量稳定的优点，但试剂盒价格昂贵，不适用于大规模临床应用；酚
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氯仿抽提法是非试剂盒抽提法中最常用的方法，但是操作步骤繁琐且易造成环境污染，不适合常规应用。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的上述不足，本专利技术的主要目的在于提供一种唾液细菌基因组DNA的提取方法，联合溶菌酶、蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)裂解法，建立一种简单、环保、低成本、高效率的细菌基因组提取方法，被命名为溶菌酶/蛋白酶K/SDS法(LPKS法)，为开展大规模唾液细菌基因/基因组检测提供实用的技术手段。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种唾液细菌基因组DNA的提取方法在大规模唾液细菌基因/基因组检测中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术还提供一种以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：采集唾液样本；
[0009]步骤2：采用LPKS法提取唾液样本基因组DNA：在所述唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即得。
[0010]作为优选，所述溶菌酶的浓度为100mg/mL，37℃水浴10
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60min。
[0011]作为优选，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，先56℃水浴10
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60min；
[0012]再转入65℃水浴10
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60min，充分裂解细菌。
[0013]作为优选，所述LPKS法提取唾液样本基因组DNA的方法包括：唾液500μL与500μL重悬液混匀，离心去上清；加入150μL重悬液重悬沉淀，加入10
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20μL100mg/mL溶菌酶，37℃水浴10
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60min；加入450μL提取液，再加入5
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20μL 20mg/mL蛋白酶K，56℃水浴10
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60min；转入65℃水浴10
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60min；12000rpm/min离心10min，取上清；加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心去上清；75％乙醇洗涤DNA沉淀；用40μL含50μg/mL RNAase的无菌水溶解DNA，即得；其中：
[0014]所述重悬液的组成为：0.1M Tris
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HCl，pH 6.8；10mM EDTA，pH 8.0；
[0015]所述提取液的组成为：0.1M Tris
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HCl，pH 8.0；2.5mM EDTA，pH 8.0；250mM NaCl；0.5％SDS。
[0016]作为优选，步骤2中LPKS法提取唾液样本基因组DNA浓度不小于60ng/μL。
[0017]本专利技术还提供所述唾液细菌基因组DNA的提取方法在以非诊断和治疗目的大规模唾液细菌基因或基因组检测中的应用。
[0018]本专利技术还提供一种以非诊断和治疗目的的检测牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)含量的方法，包括以下步骤：
[0019](1)按照所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法提取待测样本DNA，作为PCR模板；
[0020](2)分别使用P.gingivalis和通用菌的检测引物进行TaqMan探针实时荧光定量PCR反应，对P.gingivalis 16S rRNA基因特异序列和16S rRNA基因保守区域序列扩增，其中所述P.gingivalis的检测引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述通用菌的检测引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
[0021](3)根据PCR反应的扩增结果，分别得到P.gingivalis Ct值和总菌Ct值，根据公式2
ΔCt
(ΔCt＝Ct(总菌)
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Ct(牙龈卟啉单胞菌))得到P.gingivalis的相对含量。
[0022]作为优选，所述待测样本为口腔唾液。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0024]1、本专利技术建立一种高效、简易、环保且低成本的唾液细菌基因组DNA提取方法，用LPKS法提取唾液细菌基因组DNA的浓度和质量能够满足宏基因组测序和定量PCR检测的要求，具有很高的推广应用价值，有助于更广泛地开展口腔致病菌相关的临床研究及检测。
[0025]2、本专利技术采用LPKS法提取的唾液样本基因组DNA浓度大于试剂盒法，电泳条带清晰；整个提取过程可在1小时内完成，成本低于2.5元/样品；获得的样品基因组DNA可用于实时荧光定量PCR检测和宏基因组测序，是一种高效且实用、经济成本低的技术手段。
附图说明
[0026]图1为实施例中唾液样本基因组DNA的电泳图谱。
[0027]图2为实施例中宏基因组测序Krona物种注释的可视化展示图。
具体实施方式
[0028]下面通过实施例进一步详细描述本专利技术，但本专利技术不局限于这些实施例。
[0029]实施例1
[0030]1.1唾液样本采集
[0031]本实施例所用唾液样本来自专利技术人本人，取样时直接对准50mL平底离心管口吐出
唾液约5mL，放置在4℃冰箱保存待用。
[0032]1.2TIANGEN试剂盒法提取唾液样品基因组DNA
[0033]使用TIANamp Micro DNA Kit(TIANGEN，DP316)，参照试剂盒说明书的操作步骤提取唾液细菌基因组DNA，流程如下：取第一作者本人的唾液500μL，离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：采集唾液样本；步骤2：采用LPKS法提取唾液样本基因组DNA：在所述唾液样本中分步并依次加入溶菌酶、SDS和蛋白酶K，在各自适合的工作温度下进行反应，经过三步水浴法裂解细菌和释放DNA，离心，获得含DNA的上清液，用两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即得。2.根据权利要求1所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶的浓度为100mg/mL，37℃水浴10
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60min。3.根据权利要求1所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，先56℃水浴10
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60min，再转入65℃水浴10
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60min。4.根据权利要求1
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3任一项所述以非诊断和治疗目的的唾液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述LPKS法提取唾液样本基因组DNA的方法包括：唾液500μL与500μL重悬液混匀，离心去上清；加入150μL重悬液重悬沉淀，加入10
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20μL100mg/mL溶菌酶，37℃水浴10
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60min；加入450μL提取液，再加入5
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20μL 20mg/mL蛋白酶K，56℃水浴10
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60min；转入65℃水浴10
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60min，充分裂解细菌；12000rpm/min离心10min，取上清；加入两倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心去上清；75％乙醇洗涤DNA沉淀；用40μL含50...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，黄蔚，陈美华，
申请(专利权)人：上海市口腔医院上海市口腔健康中心，
类型：发明
国别省市：