一种以地下部分入药药材的DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种以地下部分入药药材DNA提取方法，属于生物技术研究领域。包括提取试剂的改良，以及提取过程的优化。其中提取试剂主要是改良了核分离液的配方：1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris

【技术实现步骤摘要】
一种以地下部分入药药材的DNA提取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种以地下部分入药药材的DNA提取方法。

技术介绍

[0002]目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定等方面，其中DNA的提取是中药材研究的重要基础，快速有效地大量提取高质量的DNA是对中药材进行基因文库构建、基因分离、遗传转化及分子鉴定的重要前提。然而大多数中药材经过加工处理后，其中所含的DNA可能会受到不同程度的降解，DNA的完整性受到破坏；其次，中药材含有的次生代谢物也影响其DNA的提取效果及后续研究。
[0003]以地下部分入药药材在中国药典616种中药材中占27.92％，包括根和根茎类、根类、根茎类、块根类、块茎类及鳞茎类药材，为中国药典中主要部分之一，广泛应用于临床中。这些药材中多数野生资源匮乏，市场供不应求，掺伪现象严重，而传统的鉴定方法有一定局限性，分子鉴定是一种有效鉴别途径。因此，如何有效地提取高质量的DNA是保证快速有效分子检测的前提和基础。但由于以地下部分入药的药材多为干品，含有大量的次生代谢产物，特别是淀粉、多糖等物质严重影响了DNA的提取效果。常规的CTAB法和SDS法能得到浓度高的DNA模板，但纯度较低；试剂盒法能得到纯度高的DNA模板，但浓度较低。因此，急需优化提取方法，获得浓度与纯度兼顾的DNA模板。本专利技术在CTAB法和试剂盒法的基础上对已有的DNA提取方法进行优化，建立一种有效和高质量的以地下部分入药药材的基因组DNA提取方法。

技术实现思路

[0004]为解决目前以地下部分入药药材DNA提取过程中的上述问题，本专利技术的目的在于提供一种以地下部分入药药材的DNA提取方法，采用改良的提取试剂，包括核裂解液、2
×
CTAB缓冲液、淀粉酶、蛋白酶K、RNaseA，使用优化的DNA提取过程，包括将CTAB步骤与试剂盒法相结合来提取以地下部分入药药材的DNA，次生代谢产物去除率高，DNA完整性好，提取方法简单易控制，能够满足后续分子生物学实验的要求。
[0005]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0006]一种以地下部分入药药材DNA提取试剂，包括核分离液、2
×
CTAB缓冲液、淀粉酶、蛋白酶K、RNaseA，所述核分离液包括：1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，0.4％β
‑
巯基乙醇，3％ PVP40，ddH2O定容至1000mL。
[0007]优选地，所述核分离液包括：NaCl 81.82g，1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)100mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)40mL，β
‑
巯基乙醇4mL，PVP40 30g，ddH2O定容至1000mL。
[0008]Tris
‑
HCl(pH8.0)主要是提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg
2+
或Mn
2+
离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使脱氧核糖核蛋白可溶；PVP40能与多糖、多酚结合形成不溶物，有效去除多酚、多糖；β
‑
巯基乙醇是一种抗氧化剂，能够防止酚类物质被氧化发生褐变，使酚类物质容易被去除。
[0009]进一步地，所述2
×
CTAB缓冲液包括：0.055mol/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，0.2％β
‑
巯基乙醇，1％PVP40，ddH2O定容至1000mL。
[0010]优选地，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 20g，NaCl 81.82g，1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)100mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)40mL，β
‑
巯基乙醇2mL，PVP40 10g，ddH2O定容至1000mL。
[0011]CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，使其分离。
[0012]进一步地，所述淀粉酶、蛋白酶K、RNaseA包括：0.1％淀粉酶10μL，100μg/μL蛋白酶K 25μL，10μg/μL RNaseA 5μL。
[0013]基于以上改进的试剂配方，具体的DNA提取步骤包括：
[0014]核分离液预处理：将研磨好的地下部分入药药材粉末与核分离液充分混合，剧烈振荡后离心，弃上清液，得到混合样本；
[0015]2×
CTAB缓冲液处理：向混合样本中加入2
×
CTAB缓冲液，振荡混匀。
[0016]酶处理：向混合样本中加入淀粉酶、蛋白酶K、RNaseA，振荡混匀，进行恒温孵育。
[0017]提取步骤处理：采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤4，5，6，7，8，9步。
[0018]进一步地，所述以地下部分入药药材粉末的质量与核分离液的体积比为(0.8
‑
1.0):(6.0
‑
7.0)。
[0019]所述混合样本与2
×
CTAB缓冲液的体积比为(0.9
‑
1.1):(0.9
‑
1.1)。
[0020]所述恒温孵育的条件为：56℃水浴8
‑
12h。
[0021]优选地，所述恒温孵育的条件为：56℃水浴12h。
[0022]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0023]1、本专利技术以地下部分入药药材DNA提取方法在CTAB处理前先进行核分离液预处理，核分离液配方与后续的CTAB缓冲液近似，可减少DNA的降解；核分离液增加了NaCl浓度，提供高盐环境，使DNA更容易充分溶解；核分离液中增加了PVP
‑
40(聚乙烯吡咯烷酮)和β
‑
巯基乙醇复合作用，在核分离阶段即进行次生代谢产物的分离，去除效果更好，更能保持DNA的完整性；CTAB缓冲液中添加PVP
‑
40和β
‑
巯基乙醇复合作用，进一步去除核酸提取液中的次生代谢产物。其中，PVP
‑
40是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除待提取样本中的多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；β
‑
巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，并使酚更多的与PVP
‑
40络合，使酚更容易去除。
[0024]2、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物；它具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在该条件下，蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以地下部分入药药材DNA提取试剂，其特征在于，包括核分离液、2
×
CTAB缓冲液、淀粉酶、蛋白酶K、RNaseA，所述核分离液包括：1.4mol/LNaCl，0.1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，0.4％β
‑
巯基乙醇，3％PVP40，ddH2O定容至1000mL。2.根据权利要求1所述的以地下部分入药药材DNA提取试剂，其特征在于，核分离液包括：NaCl 81.82g，1mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)100mL，0.5mol/LEDTA(pH 8.0)40mL，β
‑
巯基乙醇4mL，PVP40 30g，ddH2O定容至1000mL。3.根据权利要求1所述的以地下部分入药药材DNA提取试剂，其特征在于，所述2
×
CTAB缓冲液包括：0.055mol/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris
‑
HCl(pH 8.0)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，0.2％β
‑
巯基乙醇，1％PVP40，ddH2O定容至1000mL。4.根据权利要求3所述的以地下部分入药药材DNA提取试剂，其特征在于，所述2
×
CTAB缓冲液包括：CTAB 20g，NaCl 81.82g，1mol/L Tris
‑
HCl(pH8.0)100mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)40mL，β
‑
巯基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李西文，冯雪，刘姿怡，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：