携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用，涉及分子生物学和基因工程领域。本发明专利技术提供了一种核酸分子，可用于构建重组H5N8亚型禽流感病毒，该重组H5N8亚型禽流感病毒相比野生型H5N8病毒毒力减弱，且可在SPF鸡肺脏中复制并表现致病性。致病性。

【技术实现步骤摘要】
携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，尤其是涉及携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的构建及其应用。

技术介绍

[0002]禽流感病毒是A型流感病毒属的负链RNA病毒，根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原性差异可分成不同亚型，HA有16种抗原型，NA有9种抗原型，不同的HA和NA组成不同的流感病毒亚型。目前已确认可感染人的禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H5N2、H5N8、H10N7和H6N1。新型H5N8是2013年爆发的能感染人类的禽流感病毒亚型，人感染后主要表现为流感样症状，进而发展为肺炎和急性呼吸窘迫综合征等重症，患者重症比例高，致死率可达29％，因此引起了社会各界的广泛关注。
[0003]哺乳动物流感病毒的相关研究中，多是在细胞破膜基础上通过流式或者免疫荧光技术检测感染细胞中病毒的NP蛋白表达情况来进行体外研究，或通过免疫组化、荧光切片等方法来检测其体内感染情况。这些方法不仅步骤复杂、耗时长、成本高，且还不能直观分析病毒在体内的分布。利用反向遗传技术构建融合荧光报告基因的流感病毒是病毒研究领域中的一种重要技术方法。目前，携带报告基因的多种不同亚型流感病毒已成功用于体内或体外研究，包含H9N2、H7N9、H1N1等多种亚型，但还没有携带报告基因的H5N8亚型重组病毒的研究。

技术实现思路
/>[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种NS蛋白，含该NS蛋白的重组H5N8亚型禽流感病毒具有比野生型H5N8病毒减弱的毒力，且可在SPF鸡肺脏中复制并表现致病性。
[0005]本专利技术还提供一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒。
[0006]本专利技术还提供生物材料。
[0007]本专利技术还提供上述重组H5N8亚型禽流感病毒的构建方法。
[0008]本专利技术还提供上述核酸分子、生物材料、构建方法、携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒的应用。
[0009]本专利技术还提供一种基于重组H5N8亚型禽流感病毒的禽类动物感染模型的构建方法。
[0010]根据本专利技术的第一方面实施例的一种NS蛋白，所述NS蛋白的氨基酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列、mApple荧光报告基因的氨基酸序列、SEQ ID NO.2第480
‑
600位所示氨基酸序列。
[0011]根据本专利技术的一些实施例，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第第222至457位所示。
[0012]根据本专利技术的一些实施例，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第711至1418位所示。
[0013]根据本专利技术的一些实施例，所述NS蛋白由含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体表达得到。
[0014]根据本专利技术的一些实施例，所述NS蛋白还包括连接肽1和连接肽2；所述连接肽1用于连接SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列与mApple荧光报告基因的氨基酸序列；所述连接肽2用于连接mApple荧光报告基因的氨基酸序列与SEQ ID NO.2第480
‑
600位所示氨基酸序列。
[0015]根据本专利技术的一些实施例，所述连接肽1为非自剪切肽。可以为柔性连接肽或刚性连接肽。所述柔性连接肽包括但不限于GSGG。所述刚性连接肽包括但不限于EAAAK。
[0016]根据本专利技术的一些实施例，所述连接肽2为自剪切肽。所述自剪切肽包括但不限于P2A、T2A、E2A和F2A。
[0017]根据本专利技术的一些实施例，所述NS蛋白还可以包括N端或/和C端连接的标签。
[0018]根据本专利技术的第二方面实施例的一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒，所述重组H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA由如1)和2)所示的8个独立的RNA片段组成；
[0019]1)与野生型H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码HA蛋白的RNA片段1、编码NA蛋白的RNA片段2、编码M蛋白的RNA片段3、编码PA蛋白的RNA片段4、编码PB1蛋白的RNA片段5、编码PB2蛋白的RNA片段6以及编码NP蛋白的RNA片段7；
[0020]2)编码本专利技术第一方面实施例中所述的NS蛋白的RNA片段8。
[0021]根据本专利技术的一些实施例，所述野生型H5N8亚型禽流感病毒包括H5N8亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/JM01/2020株。
[0022]根据本专利技术的一些实施例，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第第222至457位所示。
[0023]根据本专利技术的一些实施例，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第711至1418位所示。
[0024]根据本专利技术的第三方面实施例的如A1至A6任一项所述的生物材料，
[0025]A1：编码本专利技术第一方面实施例中所述的NS蛋白的核酸分子；
[0026]A2：含有A1中所述核酸分子的表达盒；
[0027]A3：含有A1中所述核酸分子的重组载体；
[0028]A4：含有A1中所述核酸分子的重组微生物；
[0029]A5：含有A1中所述核酸分子的转基因细胞系；
[0030]A6：含有A1中所述核酸分子的重组病毒。
[0031]根据本专利技术的一些实施例，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0032]根据本专利技术的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述核酸分子所编码的蛋白质的DNA分子。包括但不限于启动子、转录终止序列。例如：还可以包括增强子序列。
[0033]根据本专利技术的一些实施例，所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。具体
地，可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0034]根据本专利技术的一些实施例，重组微生物具体可为细菌、酵母、藻或真菌。
[0035]根据本专利技术的一些实施例，所述转基因细胞系不包括动植物繁殖材料。
[0036]根据本专利技术的一些实施例，所述重组病毒可为携带有所述核酸分子的重组腺病毒、重组腺相关病毒等。
[0037]根据本专利技术的一些实施例，A1中所述核酸分子如B1至B3任一项所示；
[0038]B1：所述核酸分子的核苷酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.1第1
‑
710位所示核苷酸序列、所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列、SEQ ID NO.1第1419至1876位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NS蛋白，其特征在于，所述NS蛋白的氨基酸序列包括依次连接的SEQ ID NO.2第1至217位所示氨基酸序列、mApple荧光报告基因的氨基酸序列、SEQ ID NO.2第480
‑
600位所示氨基酸序列。2.一种携带mApple荧光报告基因的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述重组H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA由如1)和2)所示的8个独立的RNA片段组成；1)与野生型H5N8亚型禽流感病毒的基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码HA蛋白的RNA片段1、编码NA蛋白的RNA片段2、编码M蛋白的RNA片段3、编码PA蛋白的RNA片段4、编码PB1蛋白的RNA片段5、编码PB2蛋白的RNA片段6以及编码NP蛋白的RNA片段7；2)编码权利要求1中所述NS蛋白的RNA片段8。3.根据权利要求2所述的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述野生型H5N8亚型禽流感病毒包括H5N8亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/JM01/2020株。4.根据权利要求2所述的重组H5N8亚型禽流感病毒，其特征在于，所述mApple荧光报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2第222至457位所示；优选地，编码所述mApple荧光报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第711至1418位所示。5.如A1至A6任一项所述的生物材料，其特征在于，A1：编码权利要求1所述NS蛋白的核酸分子；A2：含有A1中所述核酸分子的表达盒；A3：含有A1中所述核酸分子的重组载体；A4：含有A1中所述核酸分子的重组微生物；A5：含有A1中所述核酸分子的转基因细胞系；A6：含有A1中所述核酸分子的重组病毒。6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，A1中所述核酸分子如B1至...

【专利技术属性】
技术研发人员：代曼曼，陈禧悦，宋薇，廖明，赵莉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：