本发明专利技术属于环境微生物技术领域，公开了基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法及其应用。该方法通过消毒技术获得纯的活的不可状态细菌，调整细菌浓度，并和不同浓度的抗生素等体积混匀孵育。完成孵育后，离心、洗涤、重悬，按照比例加入SYTO 9和PI染色剂在适宜温度中避光孵育，调整流式细胞仪的FSC、SSC、FITC和PI的电压参数，分析活的不可培养状态细菌的存活率来确定其抗生素耐药性。该方法具有可操作性强、快速、高通量、准确度高、灵敏度高且应用范围广的优势，可检测不同种类活的不可培养状态细菌对不同种类抗生素的耐药性，可应用在环境微生物技术领域中。可应用在环境微生物技术领域中。可应用在环境微生物技术领域中。
【技术实现步骤摘要】
基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法及其应用
[0001]本专利技术属于环境微生物
中的应用，更具体地，涉及一种基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法及其应用。
技术介绍
[0002]抗生素耐药性已经成为已成为全球日益严重的公共卫生问题，其威胁了人类健康和公共卫生安全。尽管抗生素耐药性是全世界关注的主要问题，但关于细菌能够通过进入休眠状态获得抗生素耐药性的事实仍被忽略。其中，活的不可培养状态细菌是典型的休眠亚群。事实上，为了逃避消毒技术造成的损害，细菌能够进行全局调控和产生一系列的应激反应来进入活的不可培养休眠状态。在进入活的不可培养状态后，细菌仍保持活性，但失去了在标准培养基上的生长能力。其表现出较低的代谢活性和较高的外排活性，因此获得暂时的抗生素耐受性，甚至会进一步发展为抗生素耐药性。这种短期抗生素耐药性能够让活的不可培养状态细菌能够抵御抗生素，无法被传统的消毒手段完全消除，这容易造成持续性及复苏后的复发性细菌感染。因此很有必要应用和开发新方法以进一步测定活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性，这对于产生新的有效干预方法以确保水和食品安全、降低公共卫生风险均非常重要。
[0003]然而，由于活的不可培养状态细菌的不可培养性，无法利用传统的基于培养的方法来检测其抗生素耐药性，这不利于研究活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性和难以开发有效控制方法。因此，目前亟需要建立一种精准调整各项参数以高效检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性的检测方法；提供一种成本低廉，原材料易得，适用范围宽，可针对不同类型细菌，可实现高通量、操作性强、相对环保的检测方法。
技术实现思路
[0004]为了解决上述活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性难以检测的问题，本专利技术提供了一种基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性的新方法。该方法可快速、高通量检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。
[0005]本专利技术采用的具体方案为：
[0006]基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法，包括以下步骤：S1.通过消毒技术获得纯的活的不可培养状态细菌，调整活的不可培养状态细菌的浓度，然后将相同体积的不同浓度的抗生素与其混匀并进行孵育；S2.离心、洗涤、重悬，加入SYTO 9和PI染色剂并避光孵育，调整流式细胞仪的FSC、SSC电压来圈选目标对象，将FITC和PI通路电压调至合适参数，画十字门，分析细菌存活率，观察活细菌群(只染上SYTO 9染色剂的细菌)的占比，将实验组相对于对照组的细菌存活率小于10％的转折点对应的抗生素浓度作为该活的不可培养状态细菌的最小杀菌浓度，然后确定所述活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。
[0007]优选地，步骤S1中所述的细菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌或粪肠球菌的一种或者以上。
[0008]优选地，步骤S1中所述的活的不可培养状态细菌的浓度为105～10
10
CFU/mL。
[0009]优选地，步骤S1中所述的抗生素种类为头孢噻肟、多粘菌素、卡那霉素或四环素的一种或者以上。
[0010]优选地，步骤S1中所述的抗生素的浓度为0.001～200000mg/L。
[0011]优选地，步骤S1中所述的抗生素孵育时间为1～48h。
[0012]优选地，步骤S2中所述SYTO 9染色剂与细菌悬浮液的混合体积比为1:1～1000000。
[0013]优选地，步骤S2中所述PI染色剂与细菌悬浮液的混合体积比为1:1～1000000。
[0014]优选地，步骤S2中所述孵育温度为4～40℃。
[0015]优选地，步骤S2中所述的染色剂孵育时间为1～240min。
[0016]优选地，步骤S3中所述流式细胞仪参数：所述的FSC电压为10～600V；所述的SSC电压为10～600V；所述的FITC通路电压为10～600V；所述的PI通路电压为10～600V。
[0017]上述基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法在环境微生物
中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果:
[0019]1、本专利技术提出了一种利用流式细胞仪检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性的方法，克服了无法用基于可培养能力的传统药敏实验来检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性的难题。
[0020]2、本专利技术使用的活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性检测方法应用范围广，可检测不同细菌种类的活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。
[0021]3、本专利技术的活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性检测方法可以检测活的不可培养状态细菌对不同种类抗生素的抗生素耐药性。
[0022]4、本专利技术活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性检测方法稳定，样本用量少，可大大提高检测速度，能够实现高通量检测，且检测准确度高、灵敏度高。
附图说明
[0023]图1为实施例1中活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性检测结果。
具体实施方式
[0024]一种基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法，包括以下步骤:
[0025]S1.通过消毒技术获得纯的活的不可培养状态细菌，调整活的不可培养状态细菌的浓度，然后将相同体积的不同浓度的抗生素与其混匀并进行孵育；
[0026]S2.离心、洗涤、重悬，加入SYTO 9和PI染色剂并在合适温度下避光孵育，调整流式细胞仪的FSC、SSC电压来圈选目标对象，将FITC和PI通路电压调至合适参数，画十字门，分析细菌存活率，观察活细菌群(只染上SYTO 9染色剂的细菌)的占比，将实验组相对于对照组的细菌存活率小于10％的转折点对应的抗生素浓度作为该活的不可培养状态细菌的最
小杀菌浓度，然后确定该活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。
[0027]本专利技术提出活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性检测方法，通过消毒技术获得纯的活的不可培养状态细菌。通过调整活的不可培养状态细菌的浓度、抗生素浓度、孵育时间等条件，然后调整染色剂浓度、染色孵育温度和孵育时间检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。基于探索的最适合条件下的浓度:活的不可培养状态细菌的浓度为105～10
10
CFU/mL，抗生素浓度为0.001～200000mg/L，抗生素孵育时间为1～48h，SYTO 9染色剂与细菌悬浮液的混合体积比为1:1～1000000，PI染色剂与细菌悬浮液的混合体积比为1:1～1000000，孵育温度为4～40℃，染色孵育为1～240min，FSC电压为10～600V，SSC电压为10～600V，所述的FITC通路电压为10～600V，所述的PI通路电压为10～600V，在合适的条件下检测活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。
[0028]下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于流式细胞术检测活的不可培养状态细菌抗生素耐药性的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.通过消毒技术获得纯的活的不可培养状态细菌，调整活的不可培养状态细菌的浓度，然后将相同体积的不同浓度的抗生素与其混匀并进行孵育；S2.离心、洗涤、重悬，加入SYTO 9和PI染色剂并避光孵育，调整流式细胞仪的FSC、SSC电压来圈选目标对象，将FITC和PI通路电压调至合适参数，画十字门，分析细菌存活率，观察活细菌群的占比，所述活细菌群是指只染上SYTO 9染色剂的细菌；将实验组相对于对照组的细菌存活率小于10％的转折点对应的抗生素浓度作为该活的不可培养状态细菌的最小杀菌浓度，然后确定所述活的不可培养状态细菌的抗生素耐药性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述的细菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌或粪肠球菌的一种或者以上。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中所述的活的不可培养状态细菌的浓度为105～10
10
CFU/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂英，刘建莹，蔡仪威，安太成，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：
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