一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法技术

本发明专利技术公开了一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，包括：体外共培养、点击化学反应、流式细胞分选。本发明专利技术基于点击化学技术，将炔基修饰的天然产物与粪便菌群共培养，通过铜催化的叠氮

【技术实现步骤摘要】
一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法


[0001]本专利技术属于生物化学
，涉及一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法；具体的说，涉及一种基于点击化学技术表征与分离能特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的方法。

技术介绍

[0002]人体肠道中生存着约10万亿个细菌，包含数百或数千个细菌分类群体，它们对人体的健康发挥至关重要的作用。肠道菌群通过初级或次级代谢途径产生许多小分子，其中一些保留在肠道中，还有一些会进入循环被宿主化学修饰或通过尿液排出。不同的肠道细菌会特异性摄取不同的营养成分，如拟杆菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属主要摄取并代谢膳食鞘氨醇，拟杆菌属，双歧杆菌属、肠球菌属和副拟杆菌属是饮食来源胆固醇的主要互作微生物。
[0003]天然产物，包括氨基酸、多糖、维生素、脂肪、生物碱、黄酮、萜类、酚类、甾体化合物等，已被证明可以通过调节肠道菌群的平衡来预防和治疗多种疾病。天然产物不仅作用于肠道菌群，通过抑制或促进部分菌属的生长，改变肠道菌群结构，进而发挥其效应，也会被肠道菌群代谢转化，包括水解、脱糖基、酶解等反应。
[0004]点击化学又称“链接化学”，是通过小单元的拼接，快速、可靠地完成各种分子的化学合成，代表反应为铜催化的叠氮
‑
炔基Husigen环加成反应。点击化学反应快速、操作简单，且反应条件温和、副产物对细胞无毒害。除了化学合成，点击化学技术已被应用于药物靶点鉴定、新药研发、癌症追踪、分子识别与传感等多个领域。
[0005]研究肠道微生物对天然产物的摄取与代谢所面临的一个巨大挑战是肠道微生物的种类繁多，使用传统的单一菌种培养的方法去筛选成千上万的分离菌种是否能代谢某种化合物成本高、周期长。且有些菌种难以分离培养，因此，传统的方法不能囊括所有的肠道微生物。
[0006]同时，单一培养的菌种和混合培养的细菌群体之间存在基因表达和生化转化过程的差异。在单一培养的细菌中不被代谢的化合物，有可能在混合培养中被细菌摄取利用，因此，传统单一菌种培养的方法并不适用于模拟肠道菌群对化合物摄取利用的高通量筛选。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，为研究天然产物和肠道微生物互作提供新思路。
[0008]本专利技术是一种基于点击化学技术快速表征与分离能特异性摄取或代谢某种天然产物的细菌方法。包括了体外共培养、点击化学反应和流式细胞分选三个步骤。与单一菌种培养研究代谢与利用的方法相比，本专利技术的方法成本低、周期短。
[0009]本专利技术基于点击化学中具有代表性的炔烃
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叠氮环加成反应，对特异性摄取或代
谢天然产物的肠道菌群进行表征与分离。天然产物结构末端使用炔基修饰，荧光染料Alexa Fluor 647末端使用叠氮修饰。细菌摄取炔基修饰的天然产物或仍然保留炔基的天然产物代谢物后，与后续加入的AF647叠氮化物进行点击化学反应，从而被标记上红色荧光。使用流式细胞分选仪分离出AF647
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的细菌群体，即获得能特异性摄取天然产物的菌群。
[0010]技术方案：本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]本专利技术提供了一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，包括以下步骤：
[0012](1)体外共培养：将菌群与天然产物在培养基中共培养；
[0013](2)点击化学反应：将经步骤(1)培养的细菌进行铜催化的叠氮化物
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炔烃环加成反应；
[0014](3)流式细胞分选：摄取天然产物或天然产物代谢物的细菌被叠氮化的荧光染料标记，通过流式细胞分选仪收集能摄取和不能摄取天然产物的细菌。
[0015]本专利技术一种优选地可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，包括以下步骤：
[0016](1)将菌群与天然产物在液体培养基中共培养，分组为：空白对照组，未修饰天然产物组和炔基修饰天然产物组；
[0017](2)收集细菌沉淀，细菌细胞固定、通透后，与叠氮荧光染料进行点击化学反应；
[0018](3)采用流式细胞分选仪，根据空白对照组和未修饰天然产物组圈出荧光信号阴性细菌群体所在区域，根据炔基修饰天然产物组圈出荧光信号阳性细菌群体所在区域；调节细胞分选参数，收集阴性和阳性的细菌群体。
[0019]进一步优选地，所述菌群为粪便菌群；所述天然产物选自姜黄素、麦角甾醇、肉豆蔻酸、牛磺酸、白藜芦醇、葛根素、雷公藤内酯酮、高黄芩素、柚皮素或槲皮苷中的任意一种。
[0020]进一步地，步骤(1)中，所述培养时间为6～48h，所述天然产物浓度为20～500μM，所述培养基组分以每升计，包括：5.0～10.0g蛋白胨，1.0～3.5g大豆胨，4.0～6.0g示胨，8.0～11.0g血清消化粉，2.0～3.0g牛肉浸粉，2.0～3.0g酵母浸粉，1.0～2.0g肝浸粉，5.0～6.0g可溶性淀粉，0.5～1.0g葡萄糖，1.0～3.0g氯化钠，2.5～3.0g磷酸二氢钾，0.2～1.0g L
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色氨酸，0.2～1.0g L
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精氨酸，0.3～1.0g L
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半胱氨酸盐酸盐，0.3～1.0g硫乙醇酸钠，0.001～0.01g氯化血红素，0.001～0.01g维生素K1。
[0021]进一步地，步骤(2)中，所述收集细菌沉淀的方法为：以18000g离心5～10min收集细菌沉淀，加入1mL 1％ BSA/PBS，洗涤三次。
[0022]进一步地，步骤(2)中，所述细胞细菌固定方法为：细菌沉淀加入0.5～1mL 4％多聚甲醛固定液，室温下固定10～20min，然后洗涤一次。
[0023]进一步地，步骤(2)中，所述通透方法为：加入0.5～1mL免疫染色通透液Triton X
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100，室温下孵育20～30min，洗涤后重悬于100～300μL 1％ BSA/PBS备用。
[0024]进一步地，步骤(2)中，所述叠氮荧光染料为Alexa Fluor 647叠氮化物。
[0025]进一步地，步骤(2)中，所述点击化学反应方法为：使用点击化学反应缓冲试剂盒(Click Chemistry Reaction Buffer Kit)，50μL菌液加入109μL反应缓冲液(Reaction Buffer A)和1μL叠氮荧光染料，叠氮荧光染料终浓度为1～10μM，短暂涡旋混合均匀；加入20μL添加剂(Additive 1)，短暂涡旋混合均匀；加入20μL硫酸铜(Copper(II)Sulfate)，短
暂涡旋混合均匀；加入10μL还原剂(Reducing Agent)，短暂涡旋混合均匀，开始点击化学反应，室温避光孵育30～60min；用1mL 1％ BSA/PBS洗涤3～5次，细菌沉淀重悬于1～1.5mL无菌PBS中备用。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)体外共培养：将菌群与天然产物在培养基中共培养；(2)点击化学反应：将经步骤(1)培养的细菌进行铜催化的叠氮化物
‑
炔烃环加成反应；(3)流式细胞分选：摄取天然产物或天然产物代谢物的细菌被叠氮化的荧光染料标记，通过流式细胞分选仪收集能摄取和不能摄取天然产物的细菌。2.根据权利要求1所述的可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将菌群与天然产物在液体培养基中共培养，分组为：空白对照组，未修饰天然产物组和炔基修饰天然产物组；(2)收集细菌沉淀，细菌固定、通透后，与叠氮荧光染料进行点击化学反应；(3)采用流式细胞分选仪，根据空白对照组和未修饰天然产物组圈出荧光信号阴性细菌群体所在区域，根据炔基修饰天然产物组圈出荧光信号阳性细菌群体所在区域；调节细胞分选参数，收集阴性和阳性的细菌群体。3.根据权利要求1或2所述的可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，其特征在于，所述菌群为粪便菌群；所述天然产物选自姜黄素、麦角甾醇、肉豆蔻酸、牛磺酸、白藜芦醇、葛根素、雷公藤内酯酮、高黄芩素、柚皮素或槲皮苷中的任意一种。4.根据权利要求1或2所述的可特异性摄取或代谢天然产物的肠道菌群的表征与分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养时间为6～48h，所述天然产物浓度为20～500μM，所述培养基组分以每升计，包括：5.0～10.0g蛋白胨，1.0～3.5g大豆胨，4.0～6.0g示胨，8.0～11.0g血清消化粉，2.0～3.0g牛肉浸粉，2.0～3.0g酵母浸粉，1.0～2.0g肝浸粉，5.0～6.0g可溶性淀粉，0.5～1.0g葡萄糖，1.0～3.0g氯化钠，2.5～3.0g磷酸二氢钾，0.2～1.0g L
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色氨酸，0.2～1.0g L
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精氨酸，0.3～1.0g L
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半胱氨酸盐酸盐，0.3～1.0g硫乙醇酸钠，0.001～0.01g氯化血红素，0.001～0.01g维生素K1。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹崇江，黄淑婷，程抒劼，赵子豪，郭宇恒，丁静怡，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：