一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶检测及其抑制剂筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶检测及其抑制剂筛选方法，基于表面等离子共振技术的生物分析传感器包括：甲基转移酶检测探针、辅助探针和重组蛋白SA

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶检测及其抑制剂筛选方法


[0001]本专利技术属于DNA甲基酶检测
，具体涉及一种基于表面等离子共振技术的M.SssI酶灵敏无标记检测方法及M.SssI酶抑制剂筛选方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]表观遗传修饰是指DNA序列保持不变，而调节基因表达，从而使基因形成可遗传的变化。真核生物的DNA甲基化是调控基因表达的一种重要表观遗传修饰。它在胚胎发生中至关重要，影响诸如印迹、X染色体失活和重复DNA沉默等过程。它的异常与一系列人类疾病有关，如自身免疫性疾病、代谢紊乱、神经系统疾病和癌症。在细胞中，DNA甲基化至少以两种方式发挥其生物学功能。第一，DNA甲基化会影响启动子区域，阻碍转录因子与基因的结合，从而直接干扰基因的激活。第二，DNA甲基化聚集与甲基CpG(mCpG)结合的蛋白质，并导致染色质形成沉默状态，从而影响基因活性。
[0004]从化学的角度来看，DNA的甲基化是在S
‑
腺苷甲硫氨酸存在的情况下，甲基转移酶将甲基修饰在CpG二核苷酸中胞嘧啶5号碳残基上。DNA甲基化的异常与DNA甲基转移酶的异常表达和活性相关。因此，DNA甲基转移酶也成为了临床诊断和药物筛选的靶点。因此，DNA甲基化转移酶的超灵敏检测对发展人类疾病的新治疗方法和策略具有重大意义。DNA甲基转移酶传统检测方法包括放射性检测法、高效液相色谱法(HPLC)、免疫分析方法和凝胶分析方法。这些方法需要对检测底物进行放射性标记，特异性抗体，因此操作复杂且成本高，灵敏度低。
[0005]为了解决这些问题，相关研究员也做了一些新的检测方法的开发，包括：荧光检测法，比浊法，化学发光法等，这些方法具有简单且灵敏的优点。但是，需要进行荧光基因和淬灭基团的标记，纳米粒子的合成。电化学法检测甲基转移酶也需要进行非甲基位点的酶切反应，步骤复杂，检测时间长。所以，该专利技术提供了一种无需荧光标记，高灵敏，操作简单和快速的检测方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种基于表面等离子共振技术(SPR)的生物分析传感器及其在甲基转移酶(M.SssI酶)检测和甲基转移酶(M.SssI酶)抑制剂筛选中的应用。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶(M.SssI酶)检测及其抑制剂筛选方法。该专利技术不需要进行荧光标记，且重组蛋白SA
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MBD分子量大，与甲基化DNA亲和力高，可实现高灵敏度检测。
[0008]为了实现上述技术效果，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种基于表面等离子共振技术(SPR)的生物分析传感器，该生物分析传感器包括：甲基转移酶(M.SssI酶)检测探针、辅助探针和重组蛋白SA
‑
MBD。该生物分析传感器可用于甲基转移酶(M.SssI酶)的检测。
[0010]其中，所述的甲基转移酶(M.SssI酶)检测探针为一个茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，该双链DNA具有甲基转移酶的识别位点；具体的，所述甲基转移酶的识别位点为5'
‑
CG
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3'的回文序列；
[0011]所述的辅助探针为一个5'末端修饰巯基的单链DNA序列；其目的是将所要检测的样品通过碱基互补配对固定在传感器表面；
[0012]所述的重组蛋白SA
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MBD以SA
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MBD重组蛋白溶液的形式加入到生物分析传感器中，该蛋白可以特异性识别CpG二核苷酸中胞嘧啶5号碳残基上的甲基位点，且该蛋白分子量大，可实现信号放大的功能；
[0013]还原后的巯基修饰探针(即辅助探针)通过金硫键将单链DNA序列固定在裸金芯片上，甲基转移酶检测探针与不同浓度的甲基转移酶和S
‑
腺苷甲硫氨酸孵育，孵育后的甲基转移酶检测探针通过碱基互补配对与单链DNA结合从而被固定在芯片上，重组蛋白SA
‑
MBD与甲基转移酶检测探针上的甲基特异性结合产生SPR信号，从而实现对甲基转移酶活性的测定。
[0014]作为一种优选技术方案，所述甲基转移酶检测探针长度为69nt，该甲基转移酶检测探针的碱基序列为：5'
‑
ATC TCG GAC ACG TGA TCG TAG AGT TTT TCT CTA CGA TCA CGT GTC CGA GAT GAC ATC CTC TCA GGT GAC
‑
3'，其中下划线标出的碱基序列CG即M.SssI甲基转移酶的识别位点。
[0015]所述辅助探针长度为28nt，该辅助探针的碱基序列为5'
‑
SH
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TTT TTT TTT TGT CAC CTG AGA GGA TGTC
‑
3'。
[0016]所述的重组蛋白SA
‑
MBD为现有技术中已公开的重组蛋白(公开号：CN115286718A)。
[0017]本专利技术还提供了上述的生物分析传感器在甲基转移酶检测或甲基转移酶抑制剂筛选中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶检测方法，采用上述的生物分析传感器检测甲基转移酶，该方法包括以下步骤：
[0019](1)辅助探针的前处理，所述的前处理包括辅助探针的还原和纯化；
[0020](2)将步骤(1)前处理后的辅助探针加在裸金芯片上进行固定；
[0021](3)向步骤(2)固定完的芯片上加入6
‑
巯基己醇进行非特异性位点封闭；
[0022](4)甲基转移反应：将待测样品加入反应溶液Ⅰ中进行孵育反应，然后进行灭活处理得到灭活溶液；
[0023](5)完成步骤(3)的芯片放入Biacore X
‑
100仪器中，通入步骤(4)中的灭活溶液；
[0024](6)通入SA
‑
MBD重组蛋白溶液；
[0025](7)通入氢氧化钠溶液进行再生。
[0026]作为一种优选技术方案，步骤(1)中所述辅助探针的还原和纯化过程包括如下步骤：
[0027]辅助探针的还原：先用磷酸盐缓冲液配制终浓度为0.1mol/L的DTT，再取100μL DTT溶解1OD的辅助探针，室温下反应还原；
[0028]还原后的辅助探针的纯化：采用NAP
TM
‑
5柱纯化还原后的辅助探针，先用KH2PO4溶液(1.0mol/L，pH 4.0)平衡柱子；再将样品装入色谱柱，使其完全进入凝胶层，最后用KH2PO4溶液洗脱样品。
[0029]作为一种优选技术方案，步骤(4)中所述的反应溶液Ⅰ中包括甲基转移酶检测探针(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面等离子共振技术的生物分析传感器，其特征在于，该生物分析传感器包括甲基转移酶检测探针、辅助探针和重组蛋白SA
‑
MBD；其中，所述的甲基转移酶检测探针为一个具有茎环结构的发夹DNA探针，两条茎结构互补形成双链DNA，该双链DNA具有甲基转移酶的识别位点；所述甲基转移酶的识别位点为5'
‑
CG
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3'的回文序列；所述的辅助探针为一个5'末端修饰巯基的单链DNA序列。2.根据权利要求1所述的生物分析传感器，其特征在于，所述甲基转移酶检测探针的碱基序列为：5'
‑
ATC TCG GAC ACG TGA TCG TAG AGT TTT TCT CTA CGA TCA CGT GTC CGA GAT GAC ATC CTC TCA GGT GAC
‑
3'。3.根据权利要求1所述的生物分析传感器，其特征在于，所述辅助探针的碱基序列为5'
‑
SH
‑
TTT TTT TTT TGT CAC CTG AGA GGA TGTC
‑
3'。4.权利要求1～3中任意一项所述的生物分析传感器在甲基转移酶检测或甲基转移酶抑制剂筛选中的应用。5.一种基于表面等离子共振技术的甲基转移酶检测方法，其特征在于，采用权利要求1～3中任意一项所述的生物分析传感器检测甲基转移酶，该方法包括以下步骤：(1)辅助探针的前处理，所述的前处理包括辅助探针的还原和纯化；(2)将步骤(1)前处理后的辅助探针加在裸金芯片上进行固定；(3)向步骤(2)固定完的芯片上加入6
‑
巯基己醇进行非特异性位点封闭；(4)甲基转移反应：将待测样品加入反应溶液Ⅰ中进行孵育反应，然后进行灭活处理得到灭活溶液；(5)完成步骤(3)的芯片放入Biacore X
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100仪器中，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云龙，顾月清，谭书琳，梁佩佩，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：