一种检测水体镉离子的荧光报告质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测水体镉离子浓度水平的荧光报告质粒载体及其应用。本发明专利技术所提供的质粒pBCCRgfp，以pBBR1MCS

【技术实现步骤摘要】
一种检测水体镉离子的荧光报告质粒载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测水体镉离子(Cd
2+
)的荧光报告质粒载体及其应用。

技术介绍

[0002]重金属镉是一种生命体非必需的元素，对人类以及其他生物具有明显的毒性。在正常的环境中，镉的含量通常较低，一般不会影响人体健康，但是镉可以通过食物链进行富集，最后进入人体，长期的积累会引起多种疾病，包括肝肾功能损伤和骨骼中钙和磷代谢紊乱等。镉主要来源于矿物，随着金属矿的采挖和冶炼，大量镉随着矿区废水和冶炼废水进入到地表水中并向周边地区扩散。除此之外，镉在工业上的应用也是造成环境镉污染的重要原因。电镀、化工和电子等工业领域对镉的需要量较大，在生产经营过程中产生大量镉超标的废水并被违规排放，造成河流水体的镉污染，进一步造成土壤的镉污染。不同于化合物类污染物，镉与其他重金属不可被降解，因此长期存在于环境中并不断累积。因此，对环境水体和土壤中镉浓度的检测是一项十分重要的工作，开发出简便有效的检测手段也更有利于检测工作的进行。
[0003]环境中的细菌常与重金属接触，已进化出了有效的抵御方式，主要是通过外排泵的表达将相应的重金属离子排到胞外，例如CzcCBA外排泵将Cd
2+
、Co
2+
和Zn
2+
排到胞外，CadA能排出胞内的Cd
2+
和Zn
2+
。细菌一般在遭受重金属胁迫的情况下，才会启动这些基因的表达，该过程需要调控蛋白的参与，例如双组分系统CzcRS能够响应Cd
2+
激活czcCBA的转录，调控因子CadR与Cd
2+
结合后能够激活cadA的转录。我们的研究发现恶臭假单胞菌中的CadR能够调控czcRS3的表达，而且该调控具有较高的严谨性，因此本专利技术利用了该调控过程，开发出一种荧光报告质粒载体，作为生物传感器检测水体样品中Cd
2+
浓度水平，为初步检测水体的Cd
2+
浓度水平提供一种简便、灵敏且易操作的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出了一种用于指示水体中重金属Cd
2+
的荧光报告质粒载体及其应用，该报告载体含有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)，该报告基因的转录受czcR3启动子控制，载体上还含有调控基因cadR，其编码的CadR能够结合在czcR3启动子上，仅当CadR与Cd
2+
结合后，能够激活czcR3启动子，启动gfp的转录，Cd
2+
浓度较高时，转录效率也随之提高。gfp的编码区前的SD序列为AGGAGA，可高效翻译以提高检测的灵敏度。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种检测水体中Cd
2+
的荧光报告质粒载体pBCCRgfp，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]所述荧光报告质粒载体的骨架为pBBR1MCS
‑
5。
[0007]所述荧光报告质粒载体上携带了来源于质粒pCdrA
‑
gfpC的gfp基因及SD序列和终止子片段。
[0008]优选地，从pCdrA
‑
gfpC上PCR扩增gfp基因的引物如下：
[0009]gfpSc：AAAGAGGAGAAATTAACTAT；
[0010]gfpA
‑
B5B：AATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCCAACGGTGGTATATCCAGTG。
[0011]所述荧光报告质粒载体上的gfp基因的转录由来源于恶臭假单胞菌KT2440的czcR3基因启动子控制。
[0012]优选地，从恶臭假单胞菌KT2440(ATCC 47054)基因组中PCR扩增czcR3基因启动子的引物如下：
[0013]1438S
‑
B5X：CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGA GCTGGCTAACGGCAAGGTG；
[0014]gfp
‑
1438a：ATAGTTAATTTCTCCTCTTTGGGGGGCTCGGTATGTTGAA。
[0015]优选地，所述的czcR3启动子片段与gfp片段通过无缝克隆连接到pBBR1MCS
‑
5骨架的XbaI和BamHI酶切位点处。
[0016]所述荧光报告质粒载体上还携带了来源于恶臭假单胞菌KT2440的调控基因cadR及其启动子。
[0017]优选地，从恶臭假单胞菌KT2440基因组中PCR扩增cadR基因的引物如下：
[0018]cadRs
‑
B5X：TGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGCTTGTGTTCGTGGCTGACAG；
[0019]cadRa
‑
B5E：ATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCAGTGATTTCTGGCTGGAAGG。
[0020]优选地，所述荧光报告质粒载体上的cadR基因通过无缝克隆连接到pBBR1MCS
‑
5骨架的XhoI和EcoRI酶切位点处。
[0021]第二方面，本专利技术还提供了荧光报告质粒载体pBCCRgfp在制备检测Cd
2+
的全细胞生物传感器中的应用。
[0022]第三方面，本专利技术还提供了一种检测Cd
2+
的全细胞生物传感器，包括宿主细胞和位于宿主细胞内的荧光报告质粒载体pBCCRgfp。
[0023]优选地，所述的宿主细胞为恶臭假单胞菌。
[0024]第四方面，本专利技术还提供了所述的荧光报告质粒载体pBCCRgfp或全细胞生物传感器在检测水体中Cd
2+
浓度水平中的应用。
[0025]第五方面，本专利技术还提供了一种荧光报告质粒载体pBCCRgfp的构建方法，包括以下步骤：
[0026]a、以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，使用引物1438S
‑
B5X和gfp
‑
1438a扩增得到czcR3启动子片段；以质粒pCdrA
‑
gfpC为模板，使用引物gfpSc和gfpA
‑
B5B扩增得到gfp片段；
[0027]b、使用限制性核酸内切酶XbaI和BamHI对质粒pBBR1MCS
‑
5进行酶切，得到线性化pBBR1MCS
‑
5；将czcR3启动子片段、gfp片段和线性化pBBR1MCS
‑
5进行连接，得到质粒pBBR1
‑
czcR3gfp；
[0028]c、对质粒pBBR1
‑
czcR3gfp进行XhoI和EcoRI酶切，得到线性化pBBR1
‑
czcR3gfp；
[0029]d、以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，使用引物cadRs
‑
B5X和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测水体中Cd
2+
的荧光报告质粒载体pBCCRgfp，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的荧光报告质粒载体，其特征在于，其质粒骨架为pBBR1MCS
‑
5，携带了来源于质粒pCdrA
‑
gfpC的gfp基因及SD序列和终止子片段，gfp基因的转录由来源于恶臭假单胞菌KT2440的czcR3基因启动子控制。3.根据权利要求2所述的荧光报告质粒载体，其特征在于，还携带了来源于恶臭假单胞菌KT2440的调控基因cadR。4.权利要求1
‑
3任一项所述的荧光报告质粒载体在制备检测Cd
2+
的全细胞生物传感器中的应用。5.一种检测Cd
2+
的全细胞生物传感器，其特征在于，包括宿主细胞和位于宿主细胞内的如权利要求1
‑
3任一项所述的荧光报告质粒载体。6.根据权利要求5所述的全细胞生物传感器，其特征在于，所述的宿主细胞为恶臭假单胞菌。7.权利要求1所述的荧光报告质粒载体或权利要求5所述的全细胞生物传感器在检测水体中Cd
2+
浓度水平中的应用。8.一种权利要求1所述的荧光报告质粒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a、以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，使用引物1438S
‑
B5X和gfp
‑
1438a扩增得到czcR3启动子片段；以质粒pCdrA
‑
gfpC为模板，使用引物gfpSc和gfpA
‑
B5B扩增得到gfp片段；b、使用限制性核酸内切酶XbaI和BamHI对质粒pBBR1MCS
‑
5进行酶切，得到线性化pBBR1MCS
‑
5；将czcR3启动子片段、gfp片段和线性化pBBR1MCS
‑
5进行连接，得到质粒pBBR1
‑
czcR3gfp；c、对质粒pBBR1
‑
czcR3gfp进行XhoI和E...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘惠忠，王颖思，谢小保，施庆珊，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：