一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种高比活绝经期促性腺素及其制备方法和用途，所述高比活绝经期促性腺素比活不低于５０００ＦＳＨ国际单位／ｍｇ蛋白。同时本发明专利技术公开了一种使用染料亲和层析色谱进行高比活绝经期促性腺素的制备的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本专利技术涉及高比活绝经期促 性腺素以及相应的纯化方法。
技术介绍
绝经期促性腺素(Human Menopausal Gonadotropins，简称HMG)含有卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone,简禾尔 FSH)禾口黄体生成激素(leuteinizing hormone,简 称LH)两种活性成分，它们是由垂体产生的糖蛋白激素，都是由a链和3链两个亚基组 成。FSH的a亚基与LH、绒毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，简称CG)的a亚基完 全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖 基化的氨基酸。FSH的0亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位 置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的0亚基由121个氨基酸组成，分子量 约为14800D ；CG的3亚基则有145个氨基酸，分子量22000-39000D。临床上HMG主要用于治疗不育症，它可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出 来，也可通过DNA重组技术而制备。含有FSH的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它是FSH 与LH比例约为1的混合物。但是它的比活和纯度都很低，比活一般在40-300IU/mg蛋白， 纯度只有2-3%的有效成分，其余约97%都是杂蛋白，由于杂蛋白含量大，对人体有潜在的 副作用，给药方式也只能局限于肌肉注射。高纯度的尿促性素(PHMG)是本领域所特别需要 的，它应当纯度高、杂质少，不含有大量的杂蛋白，因此不会造成人体的过敏反应，并且由于 这些优点它可以使用皮下注射，提高患者的顺应性。但是，pHMG的纯化很有难度，由于它同时含有FSH和LH两种成分，而且需要两者 按一定的比例构成，而FSH和LH的结构性质又不相同，因此在后期的纯化过程中很容易使 两者分离从而导致达不到希望的比例，这在PHMG的纯化中尤其突出，目前还没有关于直接 获得高比活HMG的方法的报道。因此本领域迫切需要开发出一种制备纯度高、杂质少的高比活HMG的方法，便于 使用于皮下注射，方便患者的使用、减轻痛苦。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种纯度高、杂质少的高比活HMG的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活HMG。本专利技术的又一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活HMG的药物组合物。本专利技术的再一个目的是提供由上述方法纯化得到的高比活HMG的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种高比活绝经期促性腺素(purified Human Menopausal Gonadotropins，pHMG)，所述高比活绝经期促性腺素比活不低于5000 FSH国际 单位/mg蛋白。在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素的比活为不低于6000FSH国际单 位/mg蛋白；更佳地，其比活为不低于8000FSH国际单位/mg蛋白。在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素的比活为6000-20000FSH国际单 位/mg蛋白；更佳地，其比活为8000-15000FSH国际单位/mg蛋白。在另一优选例中，所述的绝经期促性腺素来自重组的绝经期促性腺素或其变体、 或人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生 成素(LH)的生物效价比例为1 0. 1-3。在另一优选例中，所述的高比活绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体生 成素(LH)的生物效价比例为1 0.5-1.4。在本专利技术的第二方面，提供了一种如上所述的高比活绝经期促性腺素(pHMG)的 制备方法，所述的方法包括步骤将低比活HMG通过染料亲和层析纯化，得到高比活绝经期 促性腺素；所述的低比活HMG比活在2000FSH国际单位/mg蛋白以下。 v%。在另一优选例中，所述的方法包括步骤(1)将含有低比活HMG的溶液上样至染料亲和层析的层析柱上；(2)用pH6-ll的缓冲液进行洗涤；和(3)用pH6-ll的缓冲液进行洗脱，得到高比活绝经期促性腺素。在另一优选例中，所述含有低比活HMG的溶液中低比活HMG的浓度为0. 1-lOw/在另一优选例中，所述含有低比活HMG的溶液pH为4-8。 在另一优选例中，所述的缓冲液选自醋酸钠溶液、醋酸铵溶液、甘氨酸-NaOH溶 液、Tris-HCl溶液、或磷酸盐溶液。在另一优选例中，所述步骤(3)中包括下述步骤(3')用pH6-ll的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；(3")浓缩洗脱液后，加入无水乙醇，离心得到沉淀；和(3"‘)将沉淀脱水，得到干燥的高比活绝经期促性腺素。在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱的染料配基选自CibacronBlue、 Orange、Red、Green0在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱的固相载体选自皂土、玻璃微球、石 英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、或琼脂糖。在另一优选例中，所述染料亲和层析的层析柱选自Blue Sepharose FF或 BlueSepharose 6B0在本专利技术的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物中含有治疗有效量 的如上所述的高比活绝经期促性腺素和药学上可接受的载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种如上所述的高比活绝经期促性腺素的用途，用 于制备治疗不育综合症的药物。据此，本专利技术提供了一种高比活HMG及其制备方法，便于使用于皮下注射，方便患 者的使用、减轻痛苦。具体实施例方式专利技术人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现通过染料亲和层析色谱可以获得高比 活的HMG，其比活可以达到5000FSH国际单位/mg蛋白以上，是目前已知比活最高的HMG，并 且FSH和LH的生物效价比例可以在要求的范围内，如1 0.1-1 3。具体地，本专利技术将低 比活HMG通过染料亲和层析纯化，得到高比活绝经期促性腺素。如本文所用，“低比活HMG”是指比活在2000FSH国际单位(IU) /mg蛋白以下的HMG， 优选比活在40-300 FSHIU/mg蛋白。可以通过本领域熟知的方法获得低比活HMG，例如但不 限于，从绝经期妇女尿液中通过高岭土吸附、洗脱，丙酮沉淀，乙醇溶液抽提，离子交换层析 色谱(包括阳离子、阴离子色谱)，甚至疏水色谱得到。也可以通过商业渠道获得。低比活 HMG中FSH和LH的生物效价比例在1 0. 1_3范围，更多的在1 0.5-1. 4范围。如本文所用，“绝经期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互换使用，都是指一类 由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有FSH和LH两种活性成分。可以是重组的绝经期促 性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。如本文所用，“卵泡刺激素”和“FSH”可以互换使用，都是指一类用于促进精子或卵 泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌，可从绝经期妇 女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。如本文所用，“黄体生成激素”和“LH”可以互换使用，都是指是由脑垂体前叶嗜碱 性细胞分泌的，作用于成熟的卵胞，能引起排卵并生成黄体的一类激素或其变体。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高比活绝经期促性腺素（ｐｕｒｉｆｉ　ｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ　Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ，ｐＨＭＧ），其特征在于，其比活不低于５０００ＦＳＨ国际单位／ｍｇ蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：季晓铭，高霄梁，郭照晔，洪云海，季斌，严惠敏，
申请(专利权)人：上海天伟生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]