一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法；本发明专利技术的目的是提供一种斑叶杓兰繁殖的有效途径；采用的技术方案具体包括以下步骤：1）人工授粉，2）蒴果采摘，3）低温处理，4）种子消毒，碱蚀种皮，播种，5）恒温培养；本发明专利技术通过野外人工授粉、适时采摘种子、碱蚀软化种皮及去除抑制化学物质、不同的播种培养基配方及添加物对斑叶杓兰萌发的影响试验，解决了斑叶杓兰非共生无菌萌发难题，为斑叶杓兰的人工驯化、繁殖及栽培奠定基础，以更好的保护和合理利用斑叶杓兰植物资源。植物资源。植物资源。

【技术实现步骤摘要】
一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法。

技术介绍

[0002]斑叶杓兰（Cypripedium margaritaceum）兰科，杓兰属，国家Ⅱ级重点保护植物，IUCN物种红色名录濒危种，极小种群，濒危动植物种国际贸易公约（CITES）附录II级。国内仅分布在四川西南部和云南西北部的海拔2500～3600米的草坡上或疏林下。花朵外形奇特、色彩丰富而艳丽，叶片形状高雅，是高山兰科植物中观赏价值最高的类群，具有较高的园艺价值和经济价值。由于该种对生长环境要求苛刻；人类活动、放牧造成栖息地环境破坏；观赏性高而常被采挖，导致野外居群数量下降明显，杓兰属植物在自然条件下主要靠分株繁殖，年繁殖率极低，种群扩展速度慢；斑叶杓兰因其严苛的生存环境及传粉等导致野外结实率较低，通常不到10%；斑叶杓兰种子微如粉尘，没有胚乳和子叶，种皮内只有一不成熟或发育不完全的球形胚，缺乏发芽所需的营养物质；斑叶杓兰种子两层种皮包裹胚，种皮不透水、不透气且种皮含有阻碍发芽的化学物质，导致休眠，自然条件下极难萌发。故极小种群斑叶杓兰的培育研究迫在眉睫。
[0003]目前斑叶杓兰种子试管萌发研究未见有文献报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种斑叶杓兰繁殖的有效途径。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）人工授粉；2）蒴果采摘；3）低温处理：4）种子消毒，碱蚀种皮，播种；5）恒温培养。
[0006]进一步的，所述步骤1）中授粉方式为异花授粉，授粉时间选择在7月中旬至7月底，选择群落数量较多且开花植株数量较多的地块进行授粉，选择生长健康、花朵盛开且未自然授粉的植株，乳黄色带粘性的花粉块。
[0007]进一步的，所述授粉步骤中具体的授粉方法为用刀片取下唇瓣，用镊子取出花粉涂在柱头上，轻轻按压，完成授粉。
[0008]进一步的，所述步骤2）中蒴果采摘时采集授粉后90~110天的蒴果，蒴果变为紫红色，种皮白色或淡浅褐色时采收。
[0009]进一步的，在步骤3）之前还需要进行种子活力测定。
[0010]进一步的，所述步骤3）具体方法为用75%酒精擦去果面脏物，阴干，之后用无菌滤
纸包裹，放入经高温灭菌并加入干燥剂的组培瓶内，置于4℃恒温箱内30天。
[0011]进一步的，所述步骤4具体方法为将步骤3）处理后未裂开的蒴果，在无菌操作台上用75%酒精擦拭蒴果表面，等表面酒精挥发干后，用消毒刀片将蒴果剖开，取出种子置于0.1%的Hgcl2浸泡消毒10分钟，消毒后用灭菌蒸馏水冲洗6~8次，再放入0.1mol/L KOH溶液中浸泡10 分钟，腐蚀种皮,使种皮透水透气，促进种子萌发，用灭菌蒸馏水冲洗6~8次，放于垫有无菌滤纸的盘上，置于无菌操作台上晾干，用无菌药匙或接种铲将种子抖落到非共生萌发培养基中进行播种。
[0012]进一步的，所述非共生萌发培养基具体配方为：所述非共生萌发培养基具体配方为：以改良的Knudson C为基本培养基，添加20～30g/L蔗糖、20～50g/L土豆、2g/L胰蛋白胨、0.2～0.6mg/L 6
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苄氨基腺嘌呤、活性炭1g/L,用氢氧化钠溶液和盐酸调节培养基pH5.5～5.8。
[0013]进一步的，所述改良的Knudson C配方为：KH2PO4磷酸二氢钾62.5～125mg/L；Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙250～500mg/L；(NH4)2SO4硫酸铵125～250mg/L；MgSO4•
7H2O七水硫酸镁62.5～125mg/L；FeSO4·
7H2O七水硫酸亚铁6.25～12.5mg/L；MnSO4·
4H2O四水合硫酸锰1.875～3.75mg/L。
[0014]进一步的，将步骤4）播种好的培养瓶置于恒温箱进行培养，培养温度为20℃，暗培养90d左右，萌发形成原球茎，转移到新配置的培养基，所述新配置的培养基为改良的Knudson C配方，60天左右白色原球茎伸长生长形成白色或淡褐色的根状茎，进行光照培养，光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx，110天左右根状茎顶端分化处芽，芽高1.5～3cm, 根长2～5cm时出瓶移栽。
[0015]本专利技术的有益技术效果是：本专利技术通过野外人工授粉、适时采摘种子、软化种皮及去除抑制化学物质、不同的播种培养基配方及添加物对斑叶杓兰萌发的影响试验，解决了斑叶杓兰非共生无菌萌发难题，为斑叶杓兰的人工驯化、繁殖及栽培奠定基础，以更好的保护和合理利用斑叶杓兰植物资源。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1是人工授粉110天的荚果及种子；图2是TTC染色法检验斑叶杓兰种子生活力，用OLYMPUS体视显微镜观察种子染色情况，圆球形的胚染成红色、有生活力的种子；图3是采用本专利技术技术90d左右萌发形成的原球茎（1）;原球茎萌发后，60天左右白色原球茎膨大有根毛状物（2）;120天左右形成根状茎(3）；110天左右萌芽（4）。
实施方式
[0018]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
实施例
[0019]一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）人工授粉授粉方式:异花授粉；授粉地选择：选择群落数量较多且开花植株数量较多的地块进行授粉，便于观察对比；授粉季节：7月中旬至7月底斑叶杓兰进入盛花期，是人工辅助授粉最佳时间；授粉植株及花粉块选择：选择生长健康、花朵盛开且未自然授粉的植株，已完成自然授粉的植株中萼片会盖在花瓣及柱头上；选择乳黄色带粘性的花粉块，不能使用霉变或老化的花粉块；授粉方法：选择晴天，并在上午8点至12点期间进行；用刀片取下唇瓣，用镊子取出花粉涂在柱头上，轻轻按压，完成授粉。用铅笔写好标牌，挂在授粉母株上。
[0020]2）蒴果采摘采集授粉后90
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110天的蒴果，蒴果变为紫红色，种皮白色和淡浅褐色时采收。
[0021]3）低温处理种子活力测定：在无菌播种前需要进行种子活力测定以了解种胚的发育情况和生理活性，避免因使用无生活力的种子而造成的人力、物力和时间浪费。同一个蒴果中取出大部分种子用于播种，余下部分种子用于TTC染色。
[0022]低温处理：用75%酒精擦去本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）人工授粉；2）蒴果采摘；3）低温处理：4）种子消毒，碱蚀种皮，播种；5）恒温培养。2.根据权利要求1所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，所述步骤1）中授粉方式为异花授粉，授粉时间选择在7月中旬至7月底，选择群落数量较多且开花植株数量较多的地块进行授粉，选择生长健康、花朵盛开且未自然授粉的植株，乳黄色带粘性的花粉块。3.根据权利要求2所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，所述授粉步骤中具体的授粉方法为用刀片取下唇瓣，用镊子取出花粉涂在柱头上，轻轻按压，完成授粉。4.根据权利要求1所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，所述步骤2）中蒴果采摘时采集授粉后90~110天的蒴果，蒴果变为紫红色，种皮白色或淡浅褐色时采收。5.根据权利要求1所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，在步骤3）之前还需要进行种子活力测定。6.根据权利要求1所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，所述步骤3）具体方法为用75%酒精擦去果面脏物，阴干，之后用无菌滤纸包裹，放入经高温灭菌并加入干燥剂的组培瓶内，置于4℃恒温箱内30天。7.根据权利要求1所述的一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于， 所述步骤4具体方法为将步骤3）处理后未裂开的蒴果，在无菌操作台上用75%酒精擦拭蒴果表面，等表面酒精挥发干后，用消毒刀片将蒴果剖开，取出种子置于0.1%的Hgcl2浸泡消毒10分钟，消毒后用灭菌蒸馏水冲洗6~8次，再放入0.1mol/L KOH溶液中浸泡10分钟，腐蚀种皮,使种皮透水透气，促进...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏健生，耿云芬，陈中华，耿绍东，杨旸，张雪艳，张劲峰，施莹，
申请(专利权)人：迪庆藏族自治州哈巴雪山省级自然保护区管护局，
类型：发明
国别省市：