一种玉龙杓兰共生真菌及应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，特别涉及一种玉龙杓兰共生真菌及应用，该真菌的保藏名称为昆明巨丛子囊（Magnibotryascoma kunmingense）YAFEF024，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022613，保藏时间为2022年05月12日。本发明专利技术提供一种玉龙杓兰共生真菌及应用，其菌丝体提取物对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌等细菌具有较好的抗细菌活性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种玉龙杓兰共生真菌及应用


[0001]本专利技术属于微生物
，特别涉及一种玉龙杓兰共生真菌及应用。

技术介绍

[0002]共生真菌（Plant symbiotic fungi）是植物生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内，而不引起植物产生有害症状的微生物，包括菌根真菌以及生活在植物表面的内生真菌和潜伏性病原菌。植物共生真菌能产生一些次级代谢物质，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、促进作物生长以及提高作物抗病性等特性。
[0003]通常将能与植物建立互惠共生关系的真菌统称为植物互惠共生真菌，主要包括外生菌根真菌、丛枝菌根真菌、兰科菌根真菌和欧石楠菌根真菌、暗隔内生真菌、印度梨形孢、木霉、白僵菌和绿僵菌等。这些共生真菌可以在健康植物组织内定殖生活却不会对植物产生明显的伤害，还能促进植物生长，提高植物对抗胁迫能力。因此从植物共生真菌中寻找潜在的生防菌是一个非常好的选择，该领域已受到越来越多生物学家及生态学家们的关注。
[0004]玉龙杓兰（Cypripedium forrestii）是杓兰属植物，由植物学家George Forrest于1913年在云南省丽江地区采集并命名，为中国特有濒危植物。分布于中国云南西北部（丽江、中甸），生于海拔3500米的松林下、灌木丛生的坡地或开旷林地上。而目前关于玉龙杓兰的相关报道较少。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种玉龙杓兰共生真菌及应用，其菌丝体提取物对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌等细菌具有较好的抗细菌活性。
[0006]本专利技术通过下述技术方案实现： 一方面，本申请提供一种玉龙杓兰共生真菌，该真菌的保藏名称为昆明巨丛子囊菌（Magnibotryascoma kunmingense） YAFEF024，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022613，保藏时间为2022年05月12日。
[0007]可选地，所述玉龙杓兰共生真菌包括如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的引物，所述玉龙杓兰共生真菌的ITS基因序列如SEQ ID No.3所示。
[0008]一方面，本申请还提供一种含有上述玉龙杓兰共生真菌在制备抗细菌药物中的应用。
[0009]另一方面，提供一种菌剂，包括上述的玉龙杓兰共生真菌的菌丝体粗提取物和/或细胞裂解上清液和/或细胞裂解沉淀。
[0010]可选地，所述菌丝体粗提取物的提取方法，包括以下步骤： （1）将玉龙杓兰根部共生菌的菌丝体刮取规格为60mm培养皿中四分之一的菌丝放入2mL灭菌离心管中，再加入1mL无菌水，破碎2min，然后将破碎样品液取500
µ
L分别接种到每个装有培养基的350mL的组培瓶中，置于26℃恒温培养箱中，培养15d；
所述培养基包括如下组分：山核桃渣8g/瓶与液体培养基15mL/瓶，所述液体培养基包括：硝酸钠6g/L、氯化钾0.52g/L、七水硫酸镁0.52g/L与磷酸二氢钾1.52g/L； （2）将组培瓶培养的菌丝体置于60℃烘箱中干燥7h，去除培养基中的水分后，加入100mL甲醇超声震荡40min后静置48h，然后将菌液用漏斗进行分离，萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得玉龙杓兰根部共生菌培养的菌丝体粗提物。
[0011]又一方面，本申请还提供一种玉龙杓兰共生真菌的分离方法，包括以下步骤： （1）将采集的玉龙杓兰根部样品清洗干净后，用流动水冲洗24h，然后转入无菌工作台进行消毒处理。
[0012]（2）在无菌工作台中先用1L无菌水冲洗样品，放在培养皿中用接种刀切成小段放于50mL无菌离心管中；然后用体积分数为75%的乙醇浸泡1min期间不断震荡，倒掉乙醇后，用无菌水冲洗3次；无菌水冲洗后，倒入20mL配置好的体积分数为5%H2O2，浸泡3min，期间不断震荡，倒掉H2O2后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用。将玉龙杓兰根部切成长度与宽度均为0.5cm的组织块，在酒精灯火焰表面灭菌15s，把组织块等距离放在抗细菌培养基上培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养8d，获取菌丝；所述抗细菌培养基包括如下组分：固体PDA培养基+氨苄青霉素50μg/mL+卡那霉素50μg/mL； （3）将菌丝转接的到固体PDA培养基，培养8d后，对菌株进行分子鉴定，得到玉龙杓兰共生真菌。
[0013]可选地，在步骤（3）中，所述PDA固体培养基包括以下组分：马铃薯浸粉5g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1g/L、维生素B10.1g/L与琼脂16g/L。
[0014]本专利技术的有益效果是：本专利技术通过分离筛选玉龙杓兰共生真菌，其菌丝体提取物对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌等细菌具有较好的抗细菌活性。
[0015]本专利技术的菌株保藏信息如下： 菌株名称：昆明巨丛子囊菌（Magnibotryascoma kunmingense） YAFEF024； 保藏编号：CCTCC NO：M 2022613；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏时间：2022年05月12日。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为本专利技术玉龙杓兰共生真菌的菌丝生长情况图；图2为本专利技术玉龙杓兰共生真菌的抗菌活性检测结果图，a表示显著性差异分析结果，都是a表示数据可信度高；图3为本专利技术玉龙杓兰共生真菌的荧光显微镜下菌丝体图；
图4为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对缓慢芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图5为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对无乳链球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图6为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对短小芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图7为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对福氏志贺氏菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图8为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图9为本专利技术玉龙杓兰共生真菌对藤黄微球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；图10本专利技术玉龙杓兰共生真菌细胞的超声裂解上清和细胞的超声裂解沉淀样品对缓慢芽孢杆菌的抑制作用图，a表示对照组，b、c表示实验组；图11本专利技术基于ITS构建了玉龙杓兰共生真菌的系统发育树显示图。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉龙杓兰共生真菌，其特征在于，该真菌的保藏名称为昆明巨丛子囊菌（Magnibotryascoma kunmingense）YAFEF024，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022613，保藏时间为2022年05月12日。2.根据权利要求1所述的一种玉龙杓兰共生真菌，其特征在于，所述玉龙杓兰共生真菌包括如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示的引物，所述玉龙杓兰共生真菌的ITS基因序列如SEQ ID No.3所示。3.一种如权利要求1或2所述的玉龙杓兰共生真菌在制备抗细菌药物中的应用。4.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的玉龙杓兰共生真菌的菌丝体粗提取物和/或细胞裂解上清液和/或细胞裂解沉淀。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌丝体粗提取物的提取方法，包括以下步骤：（1）将玉龙杓兰根部共生菌的菌丝体刮取规格为60mm培养皿中四分之一的菌丝放入2mL灭菌离心管中，再加入1mL无菌水，破碎2min，然后将破碎样品液取500
µ
L分别接种到每个装有培养基的350mL的组培瓶中，置于26℃恒温培养箱中，培养15d；所述培养基包括如下组分：山核桃渣8g/瓶与液体培养基15mL/瓶，所述液体培养基包括：硝酸钠6g/L、氯化钾0.52g/L、七水硫酸镁0.52g/L与磷酸二氢钾1.52g/L；（2）将组培瓶培养的菌丝体置于60℃烘箱中干燥7h，去除培养基中的水分后，加入100...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，耿云芬，原晓龙，魏健生，张劲峰，
申请(专利权)人：迪庆藏族自治州哈巴雪山省级自然保护区管护局，
类型：发明
国别省市：