一种检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系、检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系、检测方法及应用，涉及分子诊断技术领域。本发明专利技术提供的由PCR缓冲液、Taqman探针和待测酶原料组成的反应体系可以真实模拟PCR检测试剂的保存条件和反应环境，通过对该反应体系进行PCR检测，可以从检测结果中准确评估微量核酸酶切割探针的速率和程度，从而检测出PCR酶原料中的核酸酶活性。同时，通过向该反应体系中添加PCR试剂，根据检测结果可以判断该PCR试剂对核酸酶活性的抑制能力，达到筛选出对PCR友好、高效的核酸酶抑制剂的作用。应用本发明专利技术方法筛选到的两类核酸酶抑制剂对荧光定量PCR(qPCR)的检测性能无明显影响，对PCR检测试剂的稳定性有明显改善，是很有潜力的PCR保护剂。的PCR保护剂。的PCR保护剂。

【技术实现步骤摘要】
一种检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，尤其涉及一种检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]分子诊断是重要的体外诊断方法，其中基于qPCR技术的核酸检测试剂在新冠病毒疫情防控中发挥了重要作用。PCR全预混反应液已经成为新的发展方向和竞争热点，对PCR检测试剂的长期稳定性提出了更高的要求。qPCR检测试剂中常见的酶原料包括Taq DNA聚合酶、anti
‑
Taq抗体、逆转录酶(RT酶)、RNA酶抑制剂、尿嘧啶DNA糖基酶(UNG酶)等。这些酶原料中的核酸酶和蛋白酶残留会对qPCR检测试剂的检测性能和稳定性造成很大影响，因此有必要对酶原料中的核酸酶和蛋白酶的活性进行有效监测。
[0003]常规的蛋白纯度测试方法包括HPLC、SDS
‑
PAGE等，这些方法都难以识别到微量的核酸酶和蛋白酶杂质，并且检测结果很难与PCR检测试剂的检测性能及稳定性建立直接关系。另外，严格的纯化标准会导致原料供应商的生产成本增加和产能下降，对PCR友好的抑制剂或保护剂可以防范酶原料品质不合格对检测试剂性能带来的风险。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何对酶原料中的核酸酶活性进行有效监测。同时，本专利技术还能提供一种对PCR友好的核酸酶抑制剂，防范核酸酶原料品质不合格对检测试剂性能带来的风险。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：<br/>[0006]第一方面，本专利技术提供一种用于检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系，由PCR缓冲液、至少一条Taqman探针和待测酶原料组成；其中，
[0007]所述Taqman探针带有荧光基团和荧光淬灭基团，含量为0.01～1μM；
[0008]所述待测酶原料选自TaqDNA聚合酶、anti
‑
Taq抗体、RT酶、RNA酶抑制剂、UNG酶中的任一种；
[0009]所述待测酶原料的含量为：Taq DNA聚合酶0.5～5U/反应、anti
‑
Taq抗体0.5～5U/反应、RT酶0.5～5U/反应、RNA酶抑制剂1～10U/反应、UNG酶1～10U/反应；
[0010]所述反应体系的总体积为10～100μL。
[0011]专利技术人发现酶原料残留的微量核酸酶会切割引物、探针和模板，进而影响PCR检测试剂的检测性能和稳定性。如果将引物和模板从PCR反应体系中移除，扩增将无法进行，而体系中的微量核酸酶对探针的切割会持续进行，表现为荧光本底的不断升高。因此，本专利技术利用由PCR缓冲液、Taqman探针和待测酶原料组成的反应体系可以真实模拟PCR检测试剂的保存条件和反应环境，准确评估反应体系中的微量核酸酶切割探针的速率和程度，作为判断PCR酶原料中核酸酶活性的依据。
[0012]进一步地，所述PCR缓冲液包括：含量为10～50mM的Tris
‑
HCl，含量为20～80mM的KCl，含量为1～5mM的MgCl2，含量为0.1～1mM的dNTPs，pH为8.0～9.0。
[0013]进一步地，所述dNTPs包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP。
[0014]进一步地，荧光Taqman探针为5
’
或3
’
端带有荧光基团，另一端或探针的中间带有荧光淬灭基团。每条Taqman探针中，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、TAMRA、HEX、CY3中的任意一种；所述荧光淬灭基团自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPSE、DABCYL中的任意一种。
[0015]需要说明的是，在所述反应体系中，可以同时使用多条荧光Taqman探针，只要不同荧光Taqman探针的收光波长互不干扰即可。
[0016]第二方面，本专利技术还提供一种PCR酶原料中核酸酶活性的检测方法，包括以下步骤：
[0017]S1、配制第一方面所述的检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系；
[0018]S2、将配好的反应体系用PCR仪进行检测，反应条件为，30
‑
40℃恒温加热，进行20
‑
50个循环，每个循环1
‑
3分钟，后10
‑
30秒采光；
[0019]S3、对检测结果进行分析，判断待测酶原料的活性：
[0020]具体为，观察荧光曲线是否满足线性，若荧光曲线满足线性，则计算前10
‑
25个循环的荧光曲线增长斜率；所述待测酶原料的活性与荧光曲线的增长斜率呈正相关。
[0021]进一步地，反应条件优选37℃恒温加热，进行30个循环，每个循环2分钟，后15秒采光。
[0022]进一步地，优选为计算前15个循环的荧光曲线增长斜率；所述荧光曲线增长斜率的计算公式为：斜率/h＝(0.5h测试值
‑
0h测试值)/(0.5
‑
0)；式中：0h测试值为第1个循环的荧光值；0.5h测试值为第16个循环的荧光值。
[0023]需要说明的是，酶原料的活性越高，切割探针的速率越高，在检测结果中表现为荧光曲线的增长斜率数值越高，因此，酶原料的活性与荧光曲线的增长斜率呈正相关。一般而言，荧光曲线的增长斜率数值在50以内的，说明体系内的酶原料的活性较低。
[0024]进一步地，所述步骤S3还包括：若荧光曲线不满足线性，则对待测酶原料稀释后重新配制反应体系进行检测。
[0025]第三方面，本专利技术还提供第二方面所述的检测方法用于筛选核酸酶活性抑制剂。
[0026]进一步地，第二方面所述的检测方法用于筛选核酸酶活性抑制剂的方法包括以下步骤，
[0027]根据第二方面所述的检测方法获知所述待测酶原料活性对应的荧光曲线增长斜率后，重新配制所述步骤S1的反应体系，并向其中添加预设浓度的待筛试剂，执行步骤S2和S3，获知添加了待筛试剂的酶原料活性对应的荧光曲线增长斜率；
[0028]若添加了待筛试剂的荧光曲线增长斜率较未添加待筛试剂的荧光曲线增长斜率下降，将所述待筛试剂作为备选试剂；
[0029]将所述备选试剂及相应的待测酶原料配制成PCR反应体系，测试所述PCR反应体系的检测性能；
[0030]若所述PCR反应体系的检测性能合格，将所述备选试剂及相应的待测酶原料配制成PCR全预混反应液，将所述PCR全预混反应液于室温下静置8
‑
20小时，测试所述PCR全预混
反应液的检测性能；
[0031]若所述PCR全预混反应液的检测性能合格，将所述备选试剂作为核酸酶活性抑制剂。
[0032]进一步地，所述检测性能包括检测PCR反应的精密度Ct值、灵敏度、非特异起线。通常而言，精密度Ct值、灵敏度、非特异起线可以反应的PCR检测性能。
[0033]待筛试剂可以是常用的PCR添加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系，其特征在于，由PCR缓冲液、至少一条Taqman探针和待测酶原料组成；其中，所述Taqman探针带有荧光基团和荧光淬灭基团，含量为0.01～1μM；所述待测酶原料选自TaqDNA聚合酶、anti
‑
Taq抗体、RT酶、RNA酶抑制剂、UNG酶中的任一种；所述待测酶原料的含量为：Taq DNA聚合酶0.5～5U/反应、anti
‑
Taq抗体0.5～5U/反应、RT酶0.5～5U/反应、RNA酶抑制剂1～10U/反应、UNG酶1～10U/反应；所述反应体系的总体积为10～100μL。2.如权利要求1所述的检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系，其特征在于，所述PCR缓冲液包括：含量为10～50mM的Tris
‑
HCl，含量为20～80mM的KCl，含量为1～5mM的MgCl2，含量为0.1～1mM的dNTPs，pH为8.0～9.0。3.如权利要求1所述的检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系，其特征在于，每条Taqman探针中，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、TAMRA、HEX、CY3中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPSE、DABCYL中的任意一种。4.一种PCR酶原料中核酸酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、配制权利要求1
‑
3任一项所述的检测PCR酶原料中核酸酶活性的反应体系；S2、将配好的反应体系用PCR仪进行检测，反应条件为，30
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40℃恒温加热，进行20
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50个循环，每个循环1
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3分钟，后10
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30秒采光；S3、对检测结果进行分析，判断待测酶原料的活性：具体为，观察荧光曲线是否满足线性，若荧光曲线满足线性，则计算前10

【专利技术属性】
技术研发人员：白金义，董璐，张良林，邹涛，蔡雨欣，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：