一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型及其构建方法与应用，属于转基因技术领域。本发明专利技术的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法包括以下步骤：基于CRISPR/Cas9技术设计靶向Pdgfrβ基因的sgRNA；对Pdgfrβ基因进行flox修饰，构建同源重组载体；将Cas9蛋白、sgRNA和同源重组载体共注射至小鼠的受精卵中；将受精卵移植至假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行基因型鉴定，筛选阳性F0小鼠；将阳性F0小鼠与野生型小鼠交配并进行基因型鉴定，获得F1代杂合子；将F1代杂合子与两个不同的特异性工具鼠配繁，筛选获得所述Pdgfrβ基因神经组织以及全身组织特异性敲除的两个小鼠模型。本发明专利技术的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法步骤简单，方法易行，周期短并且得到阳性小鼠的概率高。且得到阳性小鼠的概率高。且得到阳性小鼠的概率高。

【技术实现步骤摘要】
一种Pdgfr
β
基因特异性敲除小鼠模型及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于转基因
，具体涉及一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]血小板衍生生长因子受体(Platelet
‑
derived growth factor receptor，Pdgfr)是Pdgfr信号转导途径中的重要成员，为一种单链跨膜糖蛋白，属于III型酪氨酸蛋白激酶家族，广泛分布于中枢神经系统中，如血管平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞、神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞等。Pdgfr包括Pdgfrα和Pdgfrβ两种，在促进神经元分化与再生、新生血管形成等方面起重要作用。Pdgfrβ信号通路对于维持周细胞覆盖、血脑屏障完整性和神经功能有十分重要的作用。Pdgfr
‑
β信号可介导生后小鼠海马区的树突棘形成和记忆形成。Pdgfr
‑
β信号参与神经干细胞的自我更新和多向分化。此外，Pdgfr
‑
β信号与基底节钙化、糖尿病视网膜病变、骨髓增生性肿瘤、胶质母细胞瘤等的发生发展密切相关。因此，Pdgfr
‑
β信号对于神经保护与再生、急性缺血性脑卒中、神经退行性疾病，基底节钙化、糖尿病视网膜病变、骨髓增生性肿瘤、胶质母细胞瘤等分子机制研究及靶向治疗具有深远影响。
[0003]Pdgfr
‑
β基因神经组织以及全身组织特异性敲除小鼠的构建可为神经保护与再生、急性缺血性脑卒中、神经退行性疾病、基底节钙化、糖尿病视网膜病变、骨髓增生性肿瘤、胶质母细胞瘤等疾病的研究提供重要的小鼠工具模型。如何快速准确的构建Pdgfr
‑
β基因神经组织以及全身组织特异性敲除小鼠动物模型，是目前急需解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型及其构建方法与应用，为神经保护与再生、急性缺血性脑卒中、神经退行性疾病、基底节钙化、糖尿病视网膜病变、骨髓增生性肿瘤、胶质母细胞瘤等疾病的研究提供重要的小鼠工具模型。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0006](1)基于CRISPR/Cas9技术设计靶向Pdgfrβ基因的sgRNA；
[0007](2)对Pdgfrβ基因进行flox修饰，构建同源重组载体；
[0008](3)将Cas9蛋白、sgRNA和同源重组载体共注射至小鼠的受精卵中；
[0009](4)将步骤(3)的受精卵移植至假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行基因型鉴定，筛选阳性F0小鼠；
[0010](5)将阳性F0小鼠与野生型小鼠交配并进行基因型鉴定，获得F1代杂合子；
[0011](6)将F1代杂合子与特异性工具鼠配繁，筛选获得所述Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型。
[0012]CRISPR
‑
Cas9技术是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技
术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，但是目前还未有CRISPR
‑
Cas9定向敲除小鼠神经组织以及全身组织Pdgfrβ基因的报道。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对Pdgfrβ基因进行flox修饰，该flox小鼠与特异性的工具鼠交配后，可敲除Pdgfrβ基因第4
‑
7外显子，获得组织特异性敲除的模型小鼠，为神经保护与再生、急性缺血性脑卒中、神经退行性疾病、基底节钙化、糖尿病视网膜病变、骨髓增生性肿瘤、胶质母细胞瘤等疾病的研究提供重要的小鼠工具模型。
[0013]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述sgRNA的作用位点位于Pdgfrβ基因的4
‑
7号外显子的两侧。
[0014]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述sgRNA作用位点的DNA序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0015]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述对Pdgfrβ基因进行flox修饰具体为flox与不同特异性Cre结合后，能组织特异性敲除Pdgfrβ基因第4
‑
7外显子。
[0016]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述flox修饰位点的DNA序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
[0017]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(4)和步骤(5)的基因型鉴定的引物序列包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8中的至少一对。更优选地，所述SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物对应的扩增产物大小为4.1kb；所述SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示引物对应的扩增产物大小为4.3kb。
[0018]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型包括Pdgfrβ基因神经组织特异性敲除小鼠模型和Pdgfrβ基因全身组织特异性敲除小鼠模型。
[0019]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述Pdgfrβ基因神经组织特异性敲除小鼠模型的构建方法具体包括以下步骤：
[0020](1)基于CRISPR/Cas9技术设计靶向Pdgfrβ基因的sgRNA；
[0021](2)对Pdgfrβ基因进行flox修饰，构建同源重组载体；
[0022](3)将Cas9蛋白、sgRNA和同源重组载体共注射至小鼠的受精卵中；
[0023](4)将步骤(3)的受精卵移植至假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行基因型鉴定，筛选阳性F0小鼠；
[0024](5)将阳性F0小鼠与野生型小鼠交配并进行基因型鉴定，获得F1代杂合子；
[0025](6)将F1代杂合子与特异性nestin
‑
Cre工具鼠配繁，得到flox区域删除且Cre阳性的小鼠，再与野生型背景鼠交配得到flox区域删除且Cre阴性的小鼠，待flox区域删除且Cre阴性的小鼠性成熟后可兄妹配繁，后代将得到去除flox区域且Cre阴性的纯合子，经基因型鉴定，获得神经组织特异性敲除的模型小鼠。
[0026]作为本专利技术所述的Pdgfrβ基因神经组织特异性敲除小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述鉴定nestin
‑
cre的特异性引物包括SEQ ID No.9和SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基于CRISPR/Cas9技术设计靶向Pdgfrβ基因的sgRNA；(2)对Pdgfrβ基因进行flox修饰，构建同源重组载体；(3)将Cas9蛋白、sgRNA和同源重组载体共注射至小鼠的受精卵中；(4)将步骤(3)的受精卵移植至假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行基因型鉴定，筛选阳性F0小鼠；(5)将阳性F0小鼠与野生型小鼠交配并进行基因型鉴定，获得F1代杂合子；(6)将F1代杂合子与特异性工具鼠配繁，筛选获得所述Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型。2.根据权利要求1所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的作用位点位于Pdgfrβ基因的4
‑
7号外显子的两侧。3.根据权利要求2所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA作用位点的DNA序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求1所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述对Pdgfrβ基因进行flox修饰具体为flox与不同特异性Cre结合后，能组织特异性敲除Pdgfrβ基因第4
‑
7外显子。5.根据权利要求4所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述flox修饰位点的DNA序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。6.根据权利要求1所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5)的基因型鉴定的引物序列包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8中的至少一对。7.根据权利要求1所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型包括Pdgfrβ基因神经组织特异性敲除小鼠模型和Pdgfrβ基因全身组织特异性敲除小鼠模型。8.根据权利要求7所述的Pdgfrβ基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Pdgfrβ基因神经组织特异性敲除小鼠模型的构建方法具体包括以下步骤：(1)基于CRISPR/Cas9技术设计靶向Pdgfrβ基因的sgRNA；(2)对Pdgfrβ基因进行flox修饰，构建同源重组载体；(3)将Cas9蛋白、sgRNA和同源重组载体共注射至小鼠的受精卵中；(4)将步骤(3)的受精卵移植至假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行基因型鉴定，筛选阳性F0小鼠；(5)将阳性F0小鼠与野生型小鼠交配并进行基因型鉴定，获得F1代杂合子；(6)将F1代杂合子与特异性nestin
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Cre工具鼠配繁，得到flox区域删除且Cre阳性的小鼠，再与野生型背景鼠交配得到flox...

【专利技术属性】
技术研发人员：申杰，徐桂华，
申请(专利权)人：东莞市滨海湾中心医院东莞市太平人民医院，东莞市第五人民医院，
类型：发明
国别省市：