三唑酮人工半抗原、人工抗原、抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了三唑酮的半抗原设计与合成，以及三唑酮人工抗原和抗体的研制，及其在快速检测与亲和纯化柱领域的应用。通过三唑酮半抗原设计、连接臂引入、载体引入、合成、纯化等步骤制备出具有免疫原性的人工抗原，获得酰氧羧酸修饰的三唑酮半抗原产物。该结构的三唑酮半抗原分别与钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或鸡卵清白蛋白偶联合成免疫原和包被原，经测试该人工半抗原具备较高的免疫活性，可刺激动物免疫系统产生抗三唑酮及其代谢产物三唑醇抗体，免疫Blab/c小鼠血清抗体效价为120 000，免疫效果显著。本发明专利技术填补了当前三唑酮及其代谢产物没有合适的人工抗原用于制备特异性、高灵敏抗体的空缺，建立了三唑酮和三唑醇快速灵敏的免疫检测分析方法。检测分析方法。检测分析方法。

【技术实现步骤摘要】
三唑酮人工半抗原、人工抗原、抗体及其应用


[0001]本专利技术属于小分子化合物的免疫分析检测领域，具体涉及有机合成，免疫化学，生物化学，物理化学测定等技术。特别涉及具有功能性羧酸类基团的杀虫剂三唑酮小分子化合物半抗原、人工抗原的设计与合成，小鼠免疫，杂交瘤细胞筛选，特异性单克隆抗体的制备及其免疫分析方法的建立，具体表现在ELISA检测方法、免疫层析试纸快速检测方法和免疫亲和纯化柱的应用，并应用农产品和生态环境领域。

技术介绍

[0002]三唑酮(Triadimefon)又称粉锈宁，分子式:C
14
H
16
CIN3O2，CAS号:43121
‑
43
‑
3，是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强、双向传导功能的三唑类杀菌剂，并具有预防、铲除、治疗和熏蒸作用。对人、畜、鱼、蜜蜂低毒，对人粘膜和皮肤均无刺激性。三唑酮作为病原真菌细胞膜麦角甾醇合成抑制，在病菌体内还原成“三唑醇”而增加了毒力，对卵菌纲的疫霉(不产生麦角甾醇)无效。对锈病、白粉病和黑穗病有特效，对玉米、高粱等黑穗病、玉米圆斑病，具有较好的防治效果，可用作喷雾、拌种和土壤处理。三唑醇作为发挥药效的主要代谢产物，在食品中农药残留最大限量标准要求中，以三唑酮和三唑醇之和作为残留物评价指标。
[0003]在商品化层面，三唑酮作为第一个商业化的三唑类杀菌剂产品，首先由德国拜耳公司于1974年研制成功，三唑酮问世至今已有三十多年的应用历史。我国三唑酮从1976年开始商品化，由南开大学、上海农药研究所、沈阳化工研究院研制。由于其对作物多种病菌具有高效、内吸、广谱的作用，而成为国内应用范围广，使用较多的杀菌剂之一。在白粉病的防治上，一直以来基本上都依赖三唑酮，由于多年来连续单一使用该药剂，在我国大部分地区都已发现了三唑酮抗性菌株，因此尽快研制开发三唑类杀菌剂混剂已是当务之急，将三唑类杀菌剂与多位点保护性杀菌剂(硫磺、代森锰锌、福美双)混配，可有效地延缓抗药性的。三唑酮广泛使用的同时也带来了作物中三唑酮和代谢产物三唑醇的残留和抗性问题，通过评价作物和环境中三唑酮和三唑醇残留水平，从而有效控制其在环境中达到安全水平，对生态平衡发展意义深远。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开了三唑酮半抗原的设计、合成，三唑酮人工抗原制备及其单克隆抗体的制备。其目的是为了提供三唑酮半抗原和相应人工抗原及抗体的制备方法，并应用于样品中三唑酮的免疫快速检测分析，以及免疫亲和纯化柱用于三唑酮快速样品前处理。
[0005]本专利技术选择三唑酮为代表的醚类或类似拟除虫菊酯类化合物，将其进行半抗原设计和结构改造，获得含酰氧羧酸基团的三唑酮半抗原分子，由于三唑酮半抗原分子不具备免疫原性，需要通过大分子蛋白作为载体才能获得免疫原性，再将一定数量的半抗原分子连接于蛋白大分子，分别获得包被原和免疫原。
[0006]本专利技术独特之处在于克服了三唑酮半抗原化学合成困难，形成了1套三唑酮半抗
原合成技术路线。用于免疫动物时，可产生亲和力很高的特异性抗体，并以此建立了ELISA方法即酶联免疫分析方法，可准确检测三唑酮含量。依托特异性抗体构建琼脂糖免疫亲和纯化柱，可用于样品中微量三唑酮的快速提取前处理。
[0007]本专利技术的另一个独特之处在于，除常规的牛血清蛋白(BSA)偶联下分子作为免疫原外，还选用钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联小分子作为免疫原，在偶联反应中提高了半抗原分子与蛋白分子的偶联比，增强其免疫原性。
[0008]三唑酮的结构如下所示：
[0009][0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：三唑酮半抗原为苯环上R位点取代酰氧羧酸基团，R可以是酰氧丙酸、酰氧丁酸、酰氧戊酸、酰氧己酸衍生基团中的一种或多种，分子结构式为：
[0011][0012]进一步的，由三唑酮经硝基化、氨基化、酰化、水解反应制备获得，三唑酮半抗原由三唑酮在强碱催化条件下引入酰氧羧酸反应获得，分子结构式为：
[0013][0014]本专利技术还公开了三唑酮免疫原(SZT
‑
KLH)，是由三唑酮R位点结构改造的半抗原与KLH蛋白偶联合成，所述SZT
‑
KLH分子结构式为：
[0015][0016]本专利技术还公开了三唑酮免疫原(SZT
‑
BSA)，是由三唑酮R位点结构改造的半抗原与BSA蛋白偶联合成，所述SZT
‑
BSA分子结构式为：
[0017][0018]本专利技术还公开了三唑酮人工包被抗原(SZT
‑
OVA)，由上述的三唑酮R位点结构改造的人工半抗原与OVA蛋白偶联合成，所述SZT
‑
OVA分子结构式为：
[0019][0020]本专利技术还公开了一种三唑酮抗体，是能与三唑酮免疫原或三唑酮人工包被抗原发生特异性免疫反应的单克隆抗体。
[0021]抗三唑酮单克隆抗体，是能与SZT
‑
KLH、SZT
‑
BSA或SZT
‑
OVA、以及三唑酮化合物发生特异性免疫反应的单克隆抗体。
[0022]本专利技术还公开了一种三唑酮抗体的应用，三唑酮抗体可用于农产品、环境样品中三唑酮含量的快速灵敏检测，具体表现在ELISA免疫分析方法、免疫层析试纸快速检测方法的应用。应用领域包含粮食、蔬菜、水果等农产品，以及水、土壤等环境样品。
[0023]三唑醇经酰化一步反应制备获得三唑酮半抗原，合成路线如下：
[0024][0025]三唑酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0026](1)将三唑醇溶于10
‑
20倍当量的吡啶溶液中，加入1
‑
2倍摩尔当量的酸酐，加入适量强力催化剂4
‑
二甲氨基吡啶，搅拌条件下升温至60
‑
80℃，催化反应得到三唑酮酰氧n羧酸；
[0027](2)过滤得到的固体样品用1,4
‑
二氧六环重结晶，烘干，得到三唑酮半抗原晶体。
[0028]SZT
‑
KLH或SZT
‑
BSA的制备方法为碳二亚胺法，包括以下步骤：
[0029](1)称0.004mmoL三唑酮半抗原溶于0.5mL DMF中，加入0.008
‑
0.02mmoL N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应15min，再加入含0.004
‑
0.016mmoL二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌反应过夜。反应液即为三唑酮半抗原活化液。
[0030](3)用0.01M碳酸缓冲液(pH 9.0)配置5
‑
10mg/mL的KLH或BSA溶液，室温搅拌条件
下逐滴加入上述三唑酮半抗原活化液，再改为缓慢磁力搅拌反应4h。将反应溶液装入预处理的透析袋中，用100倍体积0.01M磷酸缓冲液(PBS)透析3次，每隔6h换液一次。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.三唑酮人工半抗原为苯环上R位点取代酰氧羧酸基团，R可以是酰氧丙酸、酰氧丁酸、酰氧戊酸、酰氧己酸衍生基团中的一种或多种，其特征在于，分子结构式为：2.根据权利要求1所述的三唑酮人工半抗原，其特征在于：由三唑酮经硝基化、氨基化、酰化、水解反应制备获得，三唑酮半抗原由三唑酮在强碱催化条件下引入酰氧羧酸反应获得，分子结构式为：3.三唑酮免疫原，其特征在于：由权利要求1或2所述三唑酮R位点结构改造的人工半抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联合成，分子结构式为：4.三唑酮免疫原，其特征在于：由权利要求1或2所述三唑酮R位点结构改造的人工半抗原与牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵颖，
申请(专利权)人：杭州佰盛汇星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：