本发明专利技术公开了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供了MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系并用其生产种子；本发明专利技术还提供一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化上述育成的紫花苜蓿雄性不育株系，使其恢复育性及野生型表型；本发明专利技术创制的紫花苜蓿雄性不育株系以及提供的恢复该雄性不育株系育性的方法，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。业生产上具有十分重要的应用。业生产上具有十分重要的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用
[0001]本专利技术涉及一种生物工程
的紫花苜蓿株系创制方法，尤其涉及一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用。
技术介绍
[0002]紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是发展草畜产业首选的牧草资源，在世界范围内广泛种植。作为典型的雌雄同花异花授粉植物，具有自交不亲和性，需采用杂交的方式进行制种。因有着明显的杂种优势，在实际应用中利用这种优势制种主要分为人工去雄杂交制种和利用核质互作雄性不育系杂交制种两条途径，后者不仅可以减少去雄用工，降低制种成本且被证明能有效培育优质苜蓿杂交品种。随着各国对优质牧草需求量的与日俱增，早日全面揭示紫花苜蓿雄性不育的机理，最大发挥其杂种优势效应是重要任务。
[0003]雄性不育对植物本身是不利于繁衍的性状，但却是在自然界中进化出的生存方式之一，利用这一性状进行重要遗传改良是目前关于紫花苜蓿育种工作的研究热点。在高等植物中，花粉发育是一个复杂的过程,其间涉及到大量基因的表达和调控。花粉作为雄配子体，包含与雌配子体结合完成受精过程的全部遗传信息,在开花植物的有性生殖过程中发挥着重要的作用，花粉发育期间的任一过程受阻都可能导致植物花粉败育，表现雄性不育性。紫花苜蓿雄性不育的发生有时空特异性，发掘和阐明其雄性不育相关基因的复杂调控网络通路，为生产实践中能更好地利用紫花苜蓿雄性不育系和杂种优势培育优质杂交种扩大紫花苜蓿产业提供理论依据。
[0004]紫花苜蓿在育种方面的研究虽一直在进行，但杂交种选育过程中优质雄性不育系与配套保持系材料筛选困难，同时作为四倍体植物，基因组相对复杂、生长周期较长等因素，也限制了其杂交、杂种优势利用在育性遗传基础和遗传模式等相关研究的进度。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是针对目前技术上的缺陷和不足，提供一种MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用及恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，利用MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其蛋白参与调控紫花苜蓿花粉败育的特点，以及利用转基因技术控制紫花苜蓿雄性生殖发育，通过抑制该蛋白产生新的紫花苜蓿雄性不育株系，通过过表达该蛋白恢复紫花苜蓿的雄性不育性。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一方面，本申请提供了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]另一方面，本申请还提供了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。
[0009]最后，本申请还提供了一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性
不育的方法，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化上述紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。
[0010]优选的，所述方法包括如下步骤：
[0011]将MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体中含有编码如如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0012]优选的，具体包括以下步骤：
[0013](a)提供携带表达MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体的农杆菌LBA4404；
[0014]在MsGDSL酯酶/脂肪酶基因全长两端添加XbaI和SacI酶切位点，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶
‑
F
‑
pBI/MsGDSL酯酶/脂肪酶
‑
R
‑
pBI，用高保真酶进行PCR扩增；
[0015]MsGDSLF酯酶/脂肪酶
‑
pBI：5
’‑
gctctagaatgaattccatgaggttaattcatgtactttggt
‑3’
和
[0016]MsGDSL酯酶/脂肪酶
‑
R
‑
pBI：5
’‑
cgagctcttataaacatgccttcccaattggaactact
‑3’
[0017]对pBI
‑
121表达载体使用同样的双酶进行37℃酶切3h后，将目的片段与去除GUS后的线性长载体相连接，转入大肠杆菌感受态细胞于LB/Kan固体培养基上培养，挑取单克隆用载体引物M13
‑
F/R进行PCR检测并测序；
[0018]M13
‑
F：5
’‑
cgccagggttttcccagtcacgac
‑3’
和
[0019]M13
‑
R：5
’‑
cacacaggaaacagctatgac
‑3’
[0020]将菌液在LB/Kan液体培养液中扩繁，测序正确后，成功构建pBI121
‑
MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体，将所得pBI121
‑
MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体倒入农杆菌；
[0021](b)将紫花苜蓿不育系细胞或组织与步骤(a)中农杆菌感受态细胞接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转入到紫花苜蓿不育系细胞，并且整合到紫花苜蓿不育系细胞的染色体上；
[0022](c)选择转入所述核苷酸的紫花苜蓿细胞或组织，再生，获得紫花苜蓿植株。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术首次从豆科植物的花药中克隆全新基因，即紫花苜蓿MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，通过控制紫花苜蓿GDSL酯酶/脂肪酶基因及其编码蛋白获得紫花苜蓿雄性生殖发育的变异株，实现控制紫花苜蓿花粉育性；本专利技术创制的紫花苜蓿雄性不育株系在营养期与来源亲本的产量及品质性状无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，得到花粉败育植株，同时专利技术恢复该雄性不育株系育性的操作方式，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。
附图说明
[0025]图1为本专利技术提供的实施例1中pRNAi
‑
MsGDSL酯酶/脂肪酶干扰表达载体构建示意图；
[0026]图2为本专利技术提供的实施例2中pBI121
‑
MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体构建示意图；
[0027]图3为本专利技术提供的不育系形态学观察示意图；
[0028]图4为本专利技术提供的恢复育性植株表征镜像图。
具体实施方式
[0029]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验步骤，通常按照常规条件。
[0030]所述的MsGDSL酯酶/脂肪酶基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0031]实本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，其特征在于，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，其特征在于，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。3.一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化权利要求2中的紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。4.根据权利要求3所述的一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体中含有编码如如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(a)提供携带表达MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体的农杆菌LBA4404；在MsGDSL酯酶/脂肪酶基因全长两端添加XbaI和SacI酶切位点，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶
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F
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pBI/MsGDSL酯酶/脂肪酶
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R
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pBI，用高保真酶进行PCR扩增；MsGDSLF酯酶/脂肪酶
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pBI：5
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gctcta...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐博，郁伟杰，王英哲，孟悦，徐安凯，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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