使用血小板裂解物制备树突状细胞的方法技术

本发明专利技术提供使用血小板裂解物，由单核细胞制备树突状细胞的方法。本发明专利技术的由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用血小板裂解物制备树突状细胞的方法


[0001]本专利技术涉及一种由单核细胞制备树突状细胞的方法。

技术介绍

[0002]已知树突状细胞(Dendritic cell：DC)是生物体内强大的抗原提呈细胞，其通过向T细胞提呈抗原来诱导免疫应答。另外，已知DC不仅直接作用于T细胞，还直接作用于B细胞、NK细胞、NKT细胞等，是在免疫反应中起中枢性作用的细胞。未成熟DC受到抗原刺激，由此随着CD40、CD80、CD86等表达上调而获得很强的刺激T细胞能力，同时转移到外周淋巴组织，通过活化对内吞的抗原具有特异性的T细胞来诱导免疫应答。
[0003]作为已认可能够从血液前驱细胞诱导树突状细胞分化的物质，一般已知有多种细胞因子。例如，有很多关于通过GM
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CSF与IL
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4同时使用来诱导DC分化的报告(非专利文献1)。此外，也报告有能够通过单独使用或与其他细胞因子同时使用来分化诱导DC的物质(非专利文献2)，例如报告有TNF
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α、IL
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2、IL
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3、IL
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6、IL
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7、IL
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12、IL
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13、IL
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15、HGF(Hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子)、CD40配体、M
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CSF、Flt3配体、C
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kit配体、TGF
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β等。
[0004]在同时使用GM
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CSF与IL
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4来诱导分化DC的方法中，是通过贴壁培养法进行的，将单个核细胞(单核细胞与淋巴细胞)接种到培养皿中，洗涤淋巴细胞，将贴壁的单核细胞用于培养。在GM
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CSF/IL
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4存在下培养5～7天，通过培养基的洗涤操作、刮削(物理性剥取)来回收细胞，更换成含有佐剂(免疫增强剂)OK432的培养基(新鲜培养基)，制作成熟的DC。
[0005]另外，还报告有使用G
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CSF制备树突状细胞的方法(专利文献1)和通过使用IFN的非贴壁培养制备树突状细胞的方法(专利文献2)。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：国际公布第WO2014/126250号
[0009]专利文献2：国际公布第WO2016/148179号
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1：Akagawa K.S.et al.,Blood,Vol.88,No.10(November 15),1996：pp.4029
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4039
[0012]非专利文献2：O
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Neill D.W.,et a.,Blood,Vol.104,No.8(October 15),2004：pp.2235
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2246

技术实现思路

[0013]专利技术所要解决的问题
[0014]本专利技术的目的在于提供使用血小板裂解物，由单核细胞制备树突状细胞的方法。
[0015]用于解决问题的技术方案
[0016]一直以来，虽然报告有由外周血中的单核细胞制备树突状细胞(DC)的方法，但是
以往的方法中，DC的收率不足。另外，为了将DC用于癌症治疗，需要DC除了强大的抗原提呈能力及吞噬能力以外还具有细胞毒性等活性。
[0017]本专利技术人等为了提高DC的收率、制作功能性高的DC而进行了潜心研究。结果发现，使用血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干扰素α(PEG
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IFN
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α)，进而从外周血分离出单核细胞，然后通过非贴壁培养即悬浮培养来制作DC，由此能够在短时间内制作优化的DC，提高制作DC的收率，从而获得的DC也具有强大的细胞毒性，直至完成了本专利技术。
[0018]即，本专利技术如下。
[0019][1]一种由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养。
[0020][2]根据[1]所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养进行2～5天的培养后，添加前列腺素E2和OK432，进一步进行1～2天的培养。
[0021][3]根据[1]或[2]所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM
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CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干扰素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的无血清培养基，对单核细胞进行培养。
[0022][4]根据[1]～[3]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，无血清培养基为DCO
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K。
[0023][5]根据[1]～[4]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞的活细胞率为90％以上，获得的树突状细胞数相对于培养时的单核细胞数的比例即收率为15％以上。
[0024][6]根据[1]～[5]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞为CD14、CD16、CD56、CD83、CD86、CCR7(CD197)、HLA
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ABC、HLA
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DR阳性。
[0025][7]一种树突状细胞，其是通过[1]～[6]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法获得的。
[0026][8]一种药物组合物，其含有[7]所述的树突状细胞。
[0027][9]根据[8]所述的药物组合物，其具有抗癌免疫活性，能够用于癌症治疗。
[0028][10]一种单核细胞的分离方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基，在贴壁培养容器中对外周血单个核细胞进行15分钟～3小时的培养，除去非贴壁细胞，回收贴壁细胞。
[0029][11]根据[10]所述的单核细胞的分离方法，其使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基。
[0030][12]根据[10]或[11]所述的单核细胞的分离方法，其中，无血清培养基为DCO
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K。
[0031][13]一种单核细胞来源的细胞毒性树突状细胞的分化诱导剂，其含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养。2.根据权利要求1所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养进行2～5天的培养后，添加前列腺素E2和OK432，进一步进行1～2天的培养。3.根据权利要求1或2所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM
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CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干扰素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的无血清培养基，对单核细胞进行培养。4.根据权利要求1～3中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，无血清培养基为DCO
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K。5.根据权利要求1～4中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞的活细胞率为90％以上，获得的树突状细胞数相对于培养时的单核细胞数的比例即收率为15％...

【专利技术属性】
技术研发人员：下平滋隆，小屋照继，坂本卓弥，硎美紗，
申请(专利权)人：学校法人金泽医科大学，
类型：发明
国别省市：