一种改良的I型内含子核酶序列用于构建环状RNA的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种改良的I型内含子核酶序列用于构建环状RNA的方法及应用。本发明专利技术提供了一种I型内含子核酶序列骨架片段，为在鱼腥藻I型内含子序列的基础上，将柯萨奇病毒内部核糖体进入位点CVB3_IRES序列拆分模拟E1和E2序列，得到具有自我剪接的特性的I型内含子核酶序列骨架片段。本发明专利技术首次利用基于鱼腥藻(Anabaena)tRNA的I型内含子核酶序列创造性的提出了解决引入多余序列的体外合成circRNA的模式，优化序列设计模式，在不影响成环的前提下，简化了序列的结构成分，保留了关键的成环序列。序列。

【技术实现步骤摘要】
一种改良的I型内含子核酶序列用于构建环状RNA的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种改良的I型内含子核酶序列用于构建环状RNA的方法及应用。

技术介绍

[0002]I型内含子核酶是最早被发现的RNA催化剂，其具有高度保守的二级结构，在镁离子和外源鸟苷酸存在情况下可发生两次转酯反应导致内含子的自我剪接和外显子的连接。已有众多学者利用重排的I型内含子核酶序列进行合成circRNA。Puttaraju M等人证实利用来自鱼腥藻(Anabaena)tRNA的I型内含子核酶序列和外显子序列可合成circRNA(Nucleic Acids Res，1992，20,5357
–
5364)。2018年，Anderson等人在Nature Communications上报道利用鱼腥藻(Anabaena)I型内含子体外转录环化成环状RNA并可以高效表达相应蛋白，其工作模式如图1A所示。但是Anderson等人报道的序列具有固有的缺点，即引入不必要的多余的序列(图1A中的E2、5
’
内部同源序列、5
’
分隔序列，3
’
内部同源序列、3
’
分隔序列和E1等序列(又称为“瘢痕”序列))。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种改良型鱼腥藻(Anabaena)I型内含子序列，其利用拆分的柯萨奇病毒内部核糖体进入位点(CVB3_IRES)序列模拟鱼腥藻内含子序列的E1和E2序列；改良后的I型内含子序列可以有效完成目的序列的环化，并且无鱼腥藻外显子序列的残留，并能实现目的序列的成功表达。
[0004]第一方面，本专利技术提供了一种I型内含子核酶序列骨架片段，为在鱼腥藻I型内含子序列的基础上，将CVB3_IRES序列拆分并优化以模拟E1和E2序列，得到具有自我剪接特性的I型内含子核酶序列骨架片段。
[0005]上文所述I型内含子核酶序列骨架片段依次包括：5
’
同源臂、鱼腥藻T4内含子3
’
端、CVB3_IRES_1、外源基因、CVB3_IRES_2、鱼腥藻T4内含子5
’
端和3
’
同源臂；
[0006]所述CVB3_IRES_1的核苷酸序列为序列1第185
‑
934位；
[0007]所述CVB3_IRES_2的核苷酸序列为序列1第1655
‑
1697位。
[0008]上文所述的I型内含子核酶序列骨架片段中，
[0009]所述5
’
同源臂的核苷酸序列为序列1第24
‑
53位；
[0010]所述鱼腥藻T4内含子3
’
端的核苷酸序列为序列1第54
‑
184位；
[0011]所述外源基因的核苷酸序列替换序列1第935
‑
1654位所在位置；
[0012]所述鱼腥藻T4内含子5
’
端的核苷酸序列为序列1第1698
‑
1813位；
[0013]所述3
’
同源臂的核苷酸序列为序列1第1814
‑
1848位。
[0014]上文所述的I型内含子核酶序列骨架片段(记作带有转录启动子的I型内含子核酶序列骨架片段)还包括位于所述5
’
同源臂上游的转录启动子。
[0015]上文所述的I型内含子核酶序列骨架片段中，
[0016]所述转录启动子为T7启动子；
[0017]所述T7启动子的核苷酸序列为序列1第1
‑
23位。
[0018]进一步地，在本专利技术的实施例中，所述外源基因以EGFP编码基因为例，所述I型内含子核酶序列骨架片段的核苷酸序列为序列1。
[0019]在本专利技术的实施例中，可以直接合成I型内含子核酶序列骨架片段。
[0020]第二方面，本专利技术提供了一种用于制备环状RNA的质粒。
[0021]本专利技术提供的质粒，为如下任一种：
[0022]1)为含有第一方面中带有转录启动子的I型内含子核酶序列骨架片段的质粒；所述I型内含子核酶序列骨架片段利用其自身的转录启动子转录；
[0023]具体委托公司合成，含有带有转录启动子的I型内含子核酶序列骨架片段的质粒；
[0024]2)为将第一方面中不带有转录启动子的I型内含子核酶序列骨架片段插入表达载体中的启动子下游，得到的质粒；所述I型内含子核酶序列骨架片段利用所述表达载体中的转录启动子转录。
[0025]在本专利技术的实施例中，采用第一种方式构建质粒，且表达载体具体为pUC57，上述含有第一方面中带有转录启动子的I型内含子核酶序列骨架片段的质粒具体为质粒pUC57
‑
cEGFP。
[0026]第三方面，本专利技术提供了一种制备环状RNA的方法，包括如下步骤：
[0027]1)将第二方面所述质粒线性化，得到线性化质粒；
[0028]所述线性化采用的酶的酶切识别位点存在于第二方面所述质粒中I型内含子核酶序列骨架片段除外的区域，也就是说，上文所述酶切识别位点不存在于所述骨架片段上；
[0029]进一步地，在本专利技术的实施例中，所述表达载体为pUC57；本实施例在所述pUC57中选择的酶切识别位点为NdeI。
[0030]2)从所述线性化质粒中扩增所述I型内含子核酶序列骨架片段，得到I型内含子核酶序列骨架片段扩增产物；
[0031]上文所述扩增采用的引物为如下：
[0032]Forward primer：TGCATCTAGATTAATACGACTCACT
[0033]Reverse primer：CTAGATATGCTGTTATCCGTCGATT。
[0034]3)体外转录所述I型内含子核酶序列骨架片段扩增产物，得到转录产物；
[0035]在本专利技术的实施例中，上述转录采用RNA合成试剂盒(E2040S，NEB，USA)。
[0036]4)向所述转录产物中添加GTP孵育，实现环化，得到环化RNA。
[0037]在本专利技术的实施例中，上述GTP在孵育体系中的终浓度为2mM，孵育的条件为55℃15min。
[0038]第四方面，本专利技术提供了一种制备环状RNA的试剂盒，其包括如下：
[0039]1)第一方面所述的I型内含子核酶序列骨架片段和表达载体；或，第二方面所述质粒；
[0040]2)第三方面中线性化所用的酶；
[0041]3)第三方面中扩增所需的引物；
[0042]4)第三方面中体外转录所需的试剂和/或仪器；
[0043]5)GTP。
[0044]本专利技术首次利用基于鱼腥藻(Anabaena)tRNA的I型内含子核酶序列创造性的提出了解决引入多余序列的体外合成circRNA的模式，具有以下优势：
[0045](1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种I型内含子核酶序列骨架片段，为在鱼腥藻I型内含子序列的基础上，将CVB3_IRES序列拆分并优化以模拟E1和E2序列，得到具有自我剪接特性的I型内含子核酶序列骨架片段。2.根据权利要求1所述的I型内含子核酶序列骨架片段，其特征在于：所述I型内含子核酶序列骨架片段依次包括：5
’
同源臂、鱼腥藻T4内含子3
’
端、CVB3_IRES_1、外源基因、CVB3_IRES_2、鱼腥藻T4内含子5
’
端和3
’
同源臂；所述CVB3_IRES_1的核苷酸序列为序列1第185
‑
934位；所述CVB3_IRES_2的核苷酸序列为序列1第1655
‑
1697位。3.根据权利要求2所述的I型内含子核酶序列骨架片段，其特征在于：所述5
’
同源臂的核苷酸序列为序列1第24
‑
53位；所述鱼腥藻T4内含子3
’
端的核苷酸序列为序列1第54
‑
184位；所述外源基因的核苷酸序列替换序列1第935
‑
1654位所在位置；所述鱼腥藻T4内含子5
’
端的核苷酸序列为序列1第1698
‑
1813位；所述3
’
同源臂的核苷酸序列为序列1第1814
‑
1848位。4.根据权利要求2或3所述的I型内...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱满堂，李浩然，刘政，蔡景升，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：