包含IL-10的双细胞因子融合蛋白制造技术

本申请涉及双细胞因子融合蛋白组合物、药物组合物和/或其制剂，所述双细胞因子融合蛋白组合物、药物组合物和/或其制剂包含与单链可变片段支架系统融合的IL

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含IL
‑
10的双细胞因子融合蛋白
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月20日提交的美国临时申请号63/054,208的优先权，优先权申请的公开内容通过引用方式完整并入本文作为参考。
专利

[0003]本公开涉及生物
，并且更具体地，涉及一种包含与其他炎性和免疫调节性细胞因子组合的白介素
‑
10(“IL
‑
10”)的新双细胞因子融合蛋白、治疗炎性和免疫性疾病或病症的方法和/或治疗癌症的方法。

技术介绍

[0004]IL
‑
10最初命名为细胞因子合成的抑制因子(Malefyt,Interleukin 10inhbits cytokine synthesis by human monocytes:An autoreglatory role of IL
‑
10produced by monocytes(白介素10抑制人单核细胞合成细胞因子：单核细胞产生的IL
‑
10的自体调节作用),1991)，已知IL
‑
10阻抑炎性反应(Fedorak,2000)并且更新近已知IL
‑
10活化CD8+T细胞以诱导干扰素γ(“IFNγ”)依赖性抗肿瘤免疫应答(Mumm J.,2011)的多效细胞因子。IL
‑
10是结构类似于IFNγ的非共价同型二聚体细胞因子。IL
‑
10结合于IL
‑
10受体，IL
‑
10受体由两个IL10受体1(IL10R1)亚基和两个IL
‑
10受体2(IL10R2)亚基组成(Moore,2001)。IL
‑
10受体复合体在大多少造血细胞的表面上表达并且在巨噬细胞和T细胞上最高度表达。尽管已经报道IL
‑
10既是免疫抑制性细胞因子(Schreiber,2000)，又是免疫刺激性细胞因子(Mumm,2011)，但对IL
‑
10治疗克罗恩病患者的临床评价产生反向的剂量反应(Fedorak,2000；Schreiber,2000)，而用聚乙二醇化IL
‑
10治疗癌症患者导致剂量可滴定的强力抗肿瘤反应(Naing,2018)。聚乙二醇化IL
‑
10抗肿瘤反应需要内源性CD8+T细胞和IFNγ(Mumm,2011)。用聚乙二醇化IL
‑
10治疗荷瘤动物导致基于每个细胞的肿瘤内CD8+T细胞增加和IFNγ升高。然而，最近经聚乙二醇化IL
‑
10治疗的癌症患者导致免疫刺激、而无抗肿瘤反应升高的证据(Spigel,2020)。
[0005]白介素
‑
2(“IL
‑
2”)是已知诱导抗肿瘤免疫应答的四螺旋束多效性细胞因子(Jiang,2016)，其还显示因天然杀伤(“NK”)细胞和CD4+T细胞激活和分泌IFNγ失控及调节性T细胞扩增(Chinen,2016)所致的高毒性。出于这个原因，许多研究小组已经尝试突变IL
‑
2以减少其与高亲和力受体的结合，旨在努力降低IL
‑
2的毒性(Chen,2018)。这些突变蛋白尚未取得实质的临床成功(Bentebibe,2019)。这提示必须利用其他机制降低IL
‑
2的潜在致死毒性。
[0006]已经报道IL
‑
10阻抑IL
‑
2驱动由NK细胞和CD4+T细胞分泌的IFNγ产生(Scott,2006)，不过还已经报道它充当IL
‑
2诱导的CD8+T细胞增殖的辅因子(Groux,1998)。因此未知IL
‑
2和IL
‑
10是否将共活化免疫系统的细胞或彼此抵消。
[0007]白介素
‑
4(“IL
‑
4”)是视为典型Th2驱动性细胞因子的四螺旋束多效性细胞因子(McGuirk,2000)，它主要与巨噬细胞驱动的备选活化相关(Balce,2011)。IL
‑
4优势地与驱
动变态反应相关性炎症和哮喘相关(Steinke,2001；Ryan,1997)。另外，已经用IL
‑
4安全地治疗癌症患者(Davis,2009)，原因在于IL
‑
4阻抑某种癌细胞增殖的能力(Lee,2016；Gooch,1998)。尽管已经报道IL
‑
4阻抑单核细胞分泌促炎细胞因子(Woodward,2012)，不视其为强力抗炎细胞因子，原因在于其引发抗原呈递细胞及驱动暴露于细菌的单核细胞分泌促炎细胞因子的能力(Varin,2010)。
[0008]惊讶地发现，在IL
‑
10受体结合结构域关键区域(SEQ ID No.3的成熟EBV IL
‑
10氨基酸序列的氨基酸位置31、75或这二者处)具有一个或多个氨基酸置换的Epstein
‑
Barr病毒(“EBV”)IL
‑
10变体改变了EBV IL
‑
10结合于并激活IL
‑
10受体的能力。这些改变包括增加EBV IL
‑
10对IL
‑
10受体的亲和力的能力。本专利技术人发现，EBV IL
‑
10变体分子充当了能够治疗免疫性疾病、炎性疾病或病症及治疗癌症的IL
‑
10受体激动剂。本专利技术人还发现，通过将单体EBV IL
‑
10变体并入包含无免疫原性重链可变区(“VH”)和轻链可变区(“VL”)的支架系统中，所产生的EBV IL
‑
10变体分子半衰期延长、正确折叠及有功能活性。向支架系统并入的EBV IL
‑
10变体对炎性细胞(例如，单核细胞/巨噬细胞/树状细胞)和免疫细胞(例如，CD8
+
T细胞)均显示增强的IL
‑
10功能。参见作为美国申请16/811,718于2020年3月6日提交的美国专利10,858,412；所述文献通过引用的方式完整并入本文作为参考。本申请聚焦于修饰前述EBV IL
‑
10支架系统以递送IL
‑
10和另一种细胞因子作为新融合蛋白结构的部分，相加地或协同地增强IL
‑
10生物学以治疗炎性疾病、免疫性疾病和/或癌症。

技术实现思路

[0009]本公开总体上涉及双细胞因子融合蛋白。
[0010]因此在第一方面，本公开涉及一种双细胞因子融合蛋白，其包含与单克隆抗体的抗原结合片段或重链可变区(“VH”)和轻链可变区(“VL”)融合的IL
‑
10或IL
‑
10变体作为第一细胞因子，和第二细胞因子，其中第二细胞因子连接于抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.双细胞因子融合蛋白，其包含与单链可变区(scFv)或单克隆抗体的抗原结合片段融合的IL
‑
10单体和第二细胞因子，其中第二细胞因子融合在scFv或抗原结合片段的VH区和VL区之间。2.式(I)的双细胞因子融合蛋白NH2‑
(IL10)
‑
(X1)
‑
(Z
n
)
‑
(X2)
‑
(IL10)
‑
COOH(式I)；其中“IL
‑
10”是选自SEQ ID No:1、3、9、10、11、12、14或16的单体序列；“X
1”是获自第一单克隆抗体的VL区或VH区；“X
2”是获自第一单克隆抗体的VH区或VL区；其中当X1是VL时，X2是VH，或者当X1是VH时，X2是VL；“Z”是除IL
‑
10之外的细胞因子；“n”是选自0
‑
2的整数。3.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中X1和X2获自对以下特异的第一单克隆抗体：表皮生长因子受体(EGFR)；CD14；CD52；多种免疫检查点靶，如但不限于PD
‑
L1、PD
‑
1、TIM3、BTLA、LAG3或CTLA4；CD20；CD47；GD
‑
2；VEGFR1、VEGFR2；HER2；PDGFR；EpCAM；ICAM(ICAM
‑
1、
‑
2、
‑
3、
‑
4、
‑
5)、VCAM、FAPα；5T4；Trop2；EDB
‑
FN；TGFβTrap；MAdCam，β7整联蛋白亚基；α4β7整联蛋白；α4整联蛋白；SR
‑
A1；SR
‑
A3；SR
‑
A4；SR
‑
A5；SR
‑
A6；SR
‑
B；dSR
‑
C1；SR
‑
D1；SR
‑
E1；SR
‑
F1；SR
‑
F2；SR
‑
G；SR
‑
H1；SR
‑
H2；SR
‑
I1；SR
‑
J1；HIV或埃博拉。4.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中VL和VH获自作为抗HIV抗体或抗埃博拉抗体的第一单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的双细胞因子融合蛋白，其中来自抗HIV或抗埃博拉单克隆抗体的VL和VH包含用来自第二抗体的6个CDR植入(置换)的6个CDR。6.根据权利要求5所述的双细胞因子融合蛋白，其中第二抗体是选自针对以下的单克隆抗体：表皮生长因子受体(EGFR)；CD14；CD52；多种免疫检查点靶，如但不限于PD
‑
L1、PD
‑
1、TIM3、BTLA、LAG3或CTLA4；CD20；CD47；GD
‑
2；VEGFR1；VEGFR2；HER2；PDGFR；EpCAM；ICAM(ICAM
‑
1、
‑
2、
‑
3、
‑
4、
‑
5)、VCAM、FAPα；5T4；Trop2；EDB
‑
FN；TGFβTrap；MAdCam，β7整联蛋白亚基；α4β7整联蛋白；α4整联蛋白；SR
‑
A1；SR
‑
A3；SR
‑
A4；SR
‑
A5；SR
‑
A6；SR
‑
B；dSR
‑
C1；SR
‑
D1；SR
‑
E1；SR
‑
F1；SR
‑
F2；SR
‑
G；SR
‑
H1；SR
‑
H2；SR
‑
I1或SR
‑
J1。7.根据权利要求5所述的双细胞因子融合蛋白，其中来自第二单克隆抗体的6个植入CDR包含来自抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗VEGFR1抗体或抗VEGFR2抗体的6个CDR，其中所述6个CDR包含来自VL的CDR 1
‑
3和来自VH的CDR 1
‑
3。8.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中Z是选自IL
‑
6、IL
‑
4、IL
‑
1、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
5、IL
‑
7、IL
‑
8、IL
‑
9、IL
‑
15、IL
‑
21、IL
‑
26、IL
‑
27、IL
‑
28、IL
‑
29、GM
‑
CSF、G
‑
CSF、干扰素
‑
α、
‑
β、
‑
γ、TGF
‑
β、或肿瘤坏死因子
‑
α、
‑
β、碱性FGF、EGF、PDGF、IL
‑
4、IL
‑
11或IL
‑
13的细胞因子。9.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中Z是IL
‑
2、IL
‑
4或IL
‑
15。10.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中Z是整数1。11.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其还包含接头。12.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中IL
‑
10是SEQ ID No:3、12、14、16。
13.根据权利要求2所述的双细胞因子融合蛋白，其中双细胞因子融合蛋白是SEQ IDNo:35、46
‑
58或59。14.式(II)的IL
‑
10融合蛋白NH2‑
(IL10)
‑
(L)
‑
(X1)
‑
(L)
‑
(Z
n
)
‑
(L)
‑
(X2)
‑
(L)
‑
(IL10)
‑
COOH(式II)；其中“IL
‑
10”是选自SEQ ID No:1、3、9、10、11、12、14或16的单体序列；“L”是SEQ ID No:39、40或41的接头；“X
1”是获自第一单克隆抗体的VL区或VH区；“X
2”是获自第一单克隆抗体的VH区或VL区；其中当X1是VL时，X2是VH，或者当X1是VH时，X2是VL；Z是选自IL
‑
6、IL
‑
4、IL
‑
1、IL
‑
2、IL
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：德卡生物科学公司，
类型：发明
国别省市：