一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用，所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株，其保藏编号为CCTCC No：V202167。本发明专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备灭活疫苗和卵黄抗体。本发明专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株具有优异的免疫原性，能够在LMH细胞上稳定传代，以其作为免疫抗原制备的灭活疫苗以及卵黄抗体，安全性好，对当前地方流行的新型鸭呼肠孤病毒引起的鸭脾坏死症有更好的保护作用，该产品具有良好的商品化开发前景。化开发前景。化开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用


[0001]本专利技术属于动物疫苗制备
，具体涉及一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用。

技术介绍

[0002]呼肠孤病毒广泛存在于家禽中，以鸡群感染的报道最为多见。临床上可引起鸡的肠炎、肝炎、神经症状、心肌炎、呼吸系统疾病和关节炎、腱鞘炎等多种疾病形式。早在1950年，Kaschula等在南非观察到番鸭呼肠孤病毒感染的病例，到20世纪70年代，该病在法国流行并成为番鸭的主要病毒病之一。1997年，我国的广州、福建、浙江等地区也出现了类似的疾病，俗称“番鸭肝白点病”或“花肝病”。到2000年胡奇林等首次分离并初步鉴定该病原为一种新型RNA病毒。吴宝成等于2001年确定该病毒为呼肠孤病毒。此后在全国范围内都有该病发生的报道出现。2006年前后，我国部分地区北京鸭商品代肉鸭群发生一种以脾脏斑块样坏死为主要特征的传染性疾病，鸭群无明显特异性症状，剖检可见特征性病变为脾脏表面有出血斑或坏死灶，被称为“鸭脾坏死症”。通过系统的实验室诊断，证实该病由一种与番鸭呼肠孤病毒相关的新型鸭呼肠孤病毒引起。
[0003]新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)属呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属，能引起雏鸭“脾坏死症”，主要临床症状表现为患鸭精神沉郁，食欲减退，羽毛蓬乱，脚软，两腿无力，多蹲伏，部分病鸭有拉稀症状，排白色稀粪，病鸭耐过后生长发育明显迟缓，成为僵鸭，影响养殖效益。其主要病理变化是脾脏肿大、坏死，表面有明显出血班或坏死灶，随病程发展，坏死灶进一步增大，并形成肉芽肿结构，感染后期，坏死区域被增生的网状细胞及内皮细胞替代。
[0004]2011年山东地区开始出现新型鸭呼肠孤病毒病，之后几年呈现区域性流行，发病率较低，但从2017年开始该病的发病率迅速上升，发病区域也不断扩大，各品种鸭均可感染，给山东省的鸭养殖业造成了很大的困扰。
[0005]目前国内、外对于鸭呼肠孤病毒病的商品化产品，仅有番鸭呼肠孤灭活疫苗一种，随着病毒的变异发展，目前新型鸭呼肠孤病毒已逐步呈大范围流行趋势，现有产品对于流行毒株无法取得良好的保护效果。因此筛选发生变异的流行毒株是新型鸭呼肠孤病毒病防控的重要环节。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用，即提供一株发生了变异的新型鸭呼肠孤病毒株。
[0007]本专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株，于2021年8月19日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V202167。
[0008]本专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备灭活疫苗；
[0009]本专利技术再一个方面还提供一种灭活疫苗，其中的抗原中使用了灭活的新型鸭呼肠
孤病毒DE株；
[0010]再一个方面，本专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株用于制备卵黄抗体；
[0011]所述的卵黄抗体可用于制备用于预防或治疗鸭脾坏死症的制品。
[0012]本专利技术所提供的新型鸭呼肠孤病毒DE株具有优异的免疫原性，能够在LMH细胞上稳定传代，以其作为免疫抗原制备的灭活疫苗以及卵黄抗体，安全性好，对当前地方流行的新型鸭呼肠孤病毒引起的鸭脾坏死症有更好的保护作用，该产品具有良好的商品化开发前景。
附图说明
[0013]图1为分离毒株的透射电镜观察图；
[0014]图2为分离毒株的抗原蛋白σC的氨基酸序列比对结果；
[0015]图3为分离毒株的遗传进化分析结果；
[0016]图4为分离毒株在LMH细胞上的细胞病变；其中，图A为正常生长状态下的LMH细胞；图B为分离毒株在LMH细胞上出现的细胞病变。
具体实施方式
[0017]本专利技术从山东省聊城市东阿县的雏鸭养殖场采集的病料中进行病毒分离鉴定，成功获得一株免疫原性良好的新型鸭呼肠孤病毒，可用于灭活疫苗及卵黄抗体的制备。
[0018]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。
[0019]实施例1：病毒株的分离鉴定
[0020]1、流行病学调查
[0021]自2011年起山东地区的雏鸭养殖出现了一种病毒传染性疾病，病鸭无明显特异性症状，主要表现为精神沉郁、不愿走动，采食量降低，病鸭耐过后生长发育不良，成为僵鸭，严重影响养殖效益。剖检观察发现主要病理变化为肝脏、脾脏的肿大、出血、斑块样坏死。
[0022]2、病毒分离
[0023]在山东省聊城市东阿县发病雏鸭养殖场取样，死亡病鸭中剖检见肝脏、脾脏肿大、出血、斑块样坏死的病症。
[0024]取病变的肝脏、脾脏组织，加入5倍体积灭菌生理盐水，充分研磨，反复冻融2次后8000r/min离心30分钟，取上清用0.22μm无菌滤器过滤除菌，经尿囊腔接种9日龄鸭胚，每胚0.1ml，36～37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的鸭胚，收获24～168小时死亡鸭胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸭胚尿囊液。
[0025]3、病毒鉴定
[0026]3.1核酸检测
[0027]取200μl病毒液，用天根生化科技(北京)有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号DP315)，提取病毒DNA及RNA。RNA进行反转录获得cDNA，反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的PrimeScript
TM RT Master Mix(货号RR036A)。获得的病毒DNA及cDNA置于4℃保存。
[0028]分别检测新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭性状病毒、H5、H7、H9亚型禽流感病毒、禽腺病毒等水禽
常见病毒病。
[0029]PCR反应体系：采用20μl体系进行扩增，模板DNA 3μl，上、下游引物各0.5μl，2
×
Premix Taq 10μl，采用ddH2O补充至20μl体系。混匀瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为94℃，5min，之后94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。
[0030]PCR结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，仅新型鸭呼肠孤病毒扩增出相应的目的片段，与预期目的片段大小相符。对扩增出的目的片段进行测序后，通过NCBI BLAST比对分析，确定该分离毒株与新型鸭呼肠孤病毒的序列同源性最接近，将该分离毒株命名为DE株。
[0031]3.2红细胞凝集试验
[0032]分别无菌采集SPF鸡和鸭血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的DE株的病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。
[0033]结果显示：分离毒株DE株均不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。
[0034本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型鸭呼肠孤病毒株，其特征在于，所述的新型鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC No：V202167。2.权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株在制备灭活疫苗中的应用。3.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中的抗原包含了灭活的权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株。4.权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒株在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：王睿智，黄冬，于春梅，丛雁方，蒋贻海，马秀丽，于可响，卜德新，张伯顺，刘丽萍，王艳玲，杨建宇，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所山东省无特定病原鸡研究中心青岛蔚蓝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：