一种检测细胞na制造技术

本发明专利技术属于细胞检测领域，提供了一种态多能性特异指征的荧光报告系统，及使用该报告系统检测细胞态多能性的方法。本发明专利技术提供了检测细胞态多能性的方法，包括以下步骤：S1，获取指征态多能性的双报告系统；S2，将所述的指征态多能性的双报告系统转入待检测的细胞中；S3，对步骤S2所获得的细胞进行荧光检测。本发明专利技术提供了一种态灵活观测荧光报告系统，利用此系统可筛选对于态多能性至关重要的因子，指征态的建立和退出，亦可筛选调控态的关键因子。态的关键因子。态的关键因子。

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞态多能性的方法及可指征态多能性的双报告系统


[0001]本专利技术属于细胞检测领域，涉及一种检测细胞态多能性的方法及指征态多能性特异的荧光报告系统，其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]在哺乳动物早期胚胎发育过程中，naive多能性的状态存在一个极短暂的过程，随着胚胎植入子宫迅速消失。与植入后处于primed态的胚胎和传统培养的人primed态多能干细胞相比，态代表着胚胎发育最初始的状态，其发育潜能及分子特征与植入前胚胎更为相似。
[0003]在体外系统中，人们通过多种方式捕获和评估态多能性。近年来的研究报道通过过表达关键外源基因、添加特定小分子抑制剂以及改变培养条件等方法，可成功的将体细胞或者处于primed态的PSCs重编程至多能性状态，或从人的植入前囊胚直接建立ESCs。并且通过分析态多能干细胞的分子和代谢特征来定义人态多能性的分子标准，包括与植入前胚胎相似的转录图谱，全基因组DNA低甲基化，不同于卵裂期胚胎的转座子特征以及具有XIST表达的活跃X染色体状态。因此，态多能干细胞为X染色体失活和X染色体相关疾病的研究提供了一个无限的细胞模型。另外，处于状态的PSCs(多能干细胞，Pluripotent stem cells)其单细胞传代的易操作性不仅显著地提高了干细胞的扩增和复苏效率，更大大增加了基因操作的可行性，因而与primed态PSCs相比，态PSCs在再生医学及个体化临床治疗方向上具有更为广阔的应用前景。
[0004]建立能够准确指征态多能性的报告系统不仅可以优化培养多能干细胞的培养条件，更有助于深入研究态多能性获得及建立的动态机制和分子特征，为未来临床医学上的应用提供重要的理论指导作用，但是目前尚未有关于可深入研究态多能性获得及建立的动态机制和分子特征的态多能性指征报告系统。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供指征态多能性的检测方法，基于指征态多能性的双报告系统，为态的动态变化、调控、追踪提供研究基础。
[0006]本专利技术近期的研究中，发现态多能干细胞膜表面特异高表达ALPPL2蛋白，而且验证其是一个特异性代表人类多能性的功能性表面分子标志物，ALPPL2(Alkaline phosphatese,placental
‑
like 2，胎盘样碱性磷酸酶)是一类组织特异性的定位于细胞膜表面的碱性磷酸酶，其主要在睾丸，胸腺及特定的生殖细胞肿瘤中表达，与胎盘及肠道形式的碱性磷酸酶密切相关；本专利技术的发现暗示可利用ALPPL2启动子序列建立报告系统对于精细准确指征态及应用方面可能发挥重要作用。
[0007]本专利技术提供了一种检测细胞态多能性的方法，包括以下步骤：
[0008]S1，获取指征态多能性的双报告系统，指征态多能性的报告系统可以称为APG/APR报告系统；
[0009]S2，将所述的指征态多能性的双报告系统转入待检测的细胞中；
[0010]S3，对步骤S2所获得的细胞进行荧光检测；
[0011]所述的指征态多能性的双报告系统是将ALPPL2蛋白编码基因的启动子替代PsicoR载体的CMV启动子后获得的双报告系统。
[0012]本专利技术中，所述的指征态多能性的双报告系统也是荧光报告系统，具备以下两个特征：
[0013]1)在PSCs而非primed PSCs中报告系统有强荧光；和
[0014]2)在报告系统强荧光表达的细胞系中，有态PSC的细胞表面标志物ALPPL2的高表达。
[0015]本专利技术提供了一种指征态多能性的双报告系统的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0016](1)获取态多能干细胞特异表面标志物ALPPL2蛋白的编码基因的启动子；
[0017](2)使用ALPPL2蛋白的编码基因的启动子(起始密码子前3.4kb)取代PsicoR载体的CMV整个启动子区域构建获得ALPPL2
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Promoter
‑
GFP/RFP表达载体；
[0018](3)将(2)中所获得的表达载体转入人态多能干细胞中，建立特异性指征态多能性的双报告系统。
[0019]本专利技术中，所述的人态多能干细胞是体外捕获状态的多能干细胞，来源参考“Identification of ALPPL2 as a Naive Pluripotent State
‑
Specific Surface Protein Essential for Human Naive Pluripotency Regulation”。
[0020]本专利技术中，ALPPL2蛋白的编码基因的启动子序列是ALPPL2的转录起始位点上游3.4kb的基因序列。其基因序列如下：
[0021]AAGACTGTGATAAACCAGCCAGGCATGGTGGCTCATGGCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGCGGGCAGATGCCTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGTCAACATGATGAAACCCTGTCTCTATTAAAAATACAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCTTGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGCATCACTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCACTCCAGCTTGGGTGACAGAGTGAAACACTGAAAAAATGTCTTTCGAAAATGAAAAAAAAAAAATACTGTTATAAACCCTTGGATTGAAAAAGTTTATAATGATAACTTCTACAGTGTAAAAAATAAAAAAGTAAAAAGAGTTAAAAAATAAAAATAAATAAATAAAATTATCAATGAACCCTAATCAGAATAAATATAAAGTTGAAAAACACACTAAACAAATCACTATATCATTCAGGAAAACATGCATATGTGGTAAAAAGCAATCAACAGCAAAGTCAAGATTAACCAAAATACAGGATAGTCATTACCTCTGGGGAGAAAGGTGGGAGACTCAAAGGCTTTAAATCTTTTTCTCAAAAAGATTTATCCCTACAGAGTAAATAAGGGTTTATTTTTGTTATTCATCTTTAAATGGAACAGATGGAAAACATTTTTTTGCATGACCACAACAAATGGAAAATATATTAATGAAGTTCAGTCACTCTTCTGTTTTACTCATAATAACAGAAGCCAGAAACCTGGGAGTTACCTTTGACCACTCCCTCACCAACCAAGTCCAATTAATTTTCACTTCTAATCACACCTATAATACCAGCACTTCGAGTGGCGGAGGCGGGCAGATCACTTGAGACCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCTTGATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞态多能性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，获取指征态多能性的双报告系统；S2，将所述的指征态多能性的双报告系统转入待检测的细胞中；S3，对步骤S2所获得的细胞进行荧光检测；所述的指征态多能性的双报告系统是将ALPPL2蛋白编码基因的启动子替代PsicoR载体的CMV启动子后获得的双报告系统。2.根据权利要求1所述的检测细胞态多能性的方法，其特征在于，所述的指征态多能性的双报告系统具备以下两个特征：1)在PSCs而非primedPSCs中报告系统有强荧光；和2)在报告系统强荧光表达的细胞系中，有态PSC的细胞表面标志物ALPPL2的高表达。3.根据权利要求1所述的检测细胞态多能性的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的待检测的细胞选自但不限于下列中的一个或者多个：态/primed态多能干细胞、诱导
‑
primed态分化的态多能干细胞、诱导primed
‑
态的转化的primed态多能干细胞、完成态/primed态体细胞重编程的体细胞。4.根据权利要求3所述的检测细胞态多能性的方法，其特征在于，所述的步骤S2包括下列中的一项或者多项：(1)将所述的指征态多能性的双报告系统转入态/primed态多能干细胞中；(2)将所述的指征态多能性的双报告系统转入态多能干细胞中，并诱导
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primed态的分化；(3)将所述的指征态多能性的双报告系统转入primed态多能干细胞中，并诱导primed
‑
态的转化；(4)将所述的指征态多能性的双报告系统转入体细胞中，并完成态/primed态体细胞重编程。5.根据权利要求1所述的检测细胞态多能性的方法，其特征在于，步骤S3还包括利用细胞流式分析技术分别检测所建立的报告系统态及primed态PSCs中的多能干细胞表面标志物ALPPL2的表达情况。6.根据权利要求1所述的检测细胞态多能性的方法，其特征在于，该方法还包括以下识别步骤：1)在
‑
primed转化系统中，所述的指征态多能性的双报告系统荧光表达强度急剧下...

【专利技术属性】
技术研发人员：高绍荣，毕焱，王译萱，涂志奋，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：