一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物分离培养技术领域，公开了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。该复合物按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4~10份，铁载体4~10份，抗毒物质0~0.5份，生长因子0~0.7份。本发明专利技术的复合物能够在较大程度上提高厌氧微生物的分离培养效果，使其在分离培养后能够获得更高的物种丰度和物种多样性。物种多样性。

【技术实现步骤摘要】
一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物分离培养
，尤其涉及一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。

技术介绍

[0002]目前，我国的微生物种质资源尤其是厌氧微生物种质资源十分缺乏。尽管微生物功能多样，开发潜力巨大、前景广阔，但得到应用的仅为冰山一角，环境中超过99％的微生物至今尚不能被分离培养。特别是厌氧微生物，它们对氧气敏感、生长条件苛刻，其种质资源挖掘难度更甚于好氧微生物，据统计，截止2020年，已分离的厌氧微生物数量低于好氧微生物至少一个数量级，仅2100多种，而学界推测原核微生物种水平的多样性可能高达106～10
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。其中大部分微生物处于活的但非可培养(VBNC，viable but non
‑
culturable)状态，是限制厌氧微生物分离的因素之一。
[0003]专利CN201910708995.X中公开了一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用，该复苏培养基在基础培养基中添加了含有复苏促进因子(Rpf)的藤黄微球菌菌液，用以促进VBNC细菌的复苏。Rpf虽然能在一定程度上促进VBNC细菌的复苏和分离培养，但单独使用时效果有限。

技术实现思路

[0004]为了解决Rpf单独使用时对VBNC细菌分离培养的促进效果有限的技术问题，本专利技术提供了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。本专利技术的复合物能够在较大程度上提高厌氧微生物的分离培养效果，使其在分离培养后能够获得更高的物种丰度和物种多样性。
[0005]本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物，按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4～10份，铁载体4～10份，抗毒物质0～0.5份，生长因子0～0.7份。
[0006]微生物只能利用Fe
2+
，难以利用Fe
3+
，而Fe
2+
难以在微生物培养环境中稳定存在，为此，本专利技术将铁载体与复苏促进因子复配，能够利用铁载体吸收环境中微量的溶解性Fe
3+
并转变成Fe
2+
，以供细胞生长，从而有效促进厌氧微生物(特别是VBNC细菌)的分离和培养，提高分离培养后获得的物种丰度和物种多样性。此外，抗毒物质能够发挥解毒作用，生长因子可促进微生物生长繁殖，将其添加到复合物中，有利于进一步提高厌氧微生物的分离培养效果。
[0007]作为优选，所述复合物按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4～6份，铁载体4～6份，抗毒物质0.2～0.5份，生长因子0.4～0.7份。
[0008]作为优选，所述抗毒物质包括还原型谷胱甘肽。
[0009]还原型谷胱甘肽(GSH)主要由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，是一种细胞内重要
的调节代谢物质，其既是甘油醛磷酸脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶及丙糖脱氢酶的辅酶，参与体内三羧酸循环及糖代谢，并能激活多种酶，如巯基(SH)酶
‑
辅酶等，从而促进糖类、脂肪和蛋白质代谢。还原型GSH分子特点是具有活性巯基(
‑
SH)，是最重要的功能集团，可参与机体多种重要的生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，具有抗氧化作用，保证能量代谢、细胞利用。当发生某些中毒时，可使这些分子中化学基因发生改变引起它们的活性改变或丧失。因此，还原型GSH在生物氧化、氨基酸转运、毒物解毒等过程中起一定作用，能够促进厌氧微生物的分离培养。
[0010]作为优选，所述生长因子包括红糖。
[0011]红糖因没有经过高度精练，几乎含有蔗汁中的全部成分，除了具备糖的功能外，还含有维生素与微量元素，如铁、锌、锰、铬等，可作为微生物生长的微量元素和生长因子，促进厌氧微生物的分离培养。
[0012]作为优选，所述复合物为粉剂或液体制剂。
[0013]作为优选，所述铁载体采用微杆菌BAB7发酵制备；所述微杆菌BAB7已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.。
[0014]微杆菌BAB7菌株提取自东海及南海滩涂泥样，其生理生化特性见实施例1，16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，与已知种的微生物具有明显不同的分类学特征，故鉴定为微杆菌属(Microbacterium)内的一个新种，暂命名为Microbacterium sp.BAB7。
[0015]微杆菌BAB7在限制性铁离子条件下，具有较高的产铁载体的能力。经试验，按体积分数1％接种量将种子液(OD
600
＝1.0)接种至100mL不含铁离子的基础液体培养基中，发酵培养4～5d后，培养基中铁载体的含量可达6.8mmol/L。并且，经鉴定，其产生的铁载体为异羟肟酸型。
[0016]此外，微杆菌BAB7能够耐受较宽的pH范围，特别是对酸性环境的耐受性较高，在pH 4.0～9.0下均具有产铁载体能力，在pH 5.0～8.0下能实现较高的产铁载体效率。并且，受限于能够合成的酶的种类，微生物能够利用的碳源类型是有限的，且不同菌种之间、同种内不同菌株之间存在差异，本专利技术的菌株能够利用的碳源种类较多，大部分碳源(包括乙酸钠、L
‑
阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖、蔗糖)均能促进其产生铁载体。这种能耐受较宽的pH范围并能利用大部分碳源的特性，能够降低发酵生产铁载体时菌株对于发酵环境的要求。
[0017]作为优选，所述铁载体的制备方法包括以下步骤：(1.1)对微杆菌BAB7进行活化和扩大培养，获得种子液；(1.2)将种子液接种到微杆菌发酵培养基中，进行微杆菌发酵培养，而后去除微杆菌菌体，干燥，获得铁载体。
[0018]本专利技术中的铁载体采用微生物发酵粗品液干燥后获得，无需经过提纯及基因工程，制作工艺简单，易获得。
[0019]进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基中含有碳源；所述碳源包括乙酸钠、L
‑
阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种。
[0020]上述碳源均对微杆菌BAB7产铁载体有促进作用，其中，蔗糖最佳，其次为葡萄糖和
甘油。
[0021]进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基中Fe
3+
的含量为0～1.23mmol/L，进一步优选为0mmol/L。
[0022]Fe
3+
会抑制细菌产生铁载体。对于本专利技术中使用的菌株BAB7而言，当Fe
3+
含量在0～1.23mmol/L范围内时，产铁载体能力相对较高。
[0023]进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5～12g/L、酵母提取物0.1～0.2g/L、(NH4)2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物，其特征在于，按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4~10份，铁载体4~10份，抗毒物质0~0.5份，生长因子0~0.7份。2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4~6份，铁载体4~6份，抗毒物质0.2~0.5份，生长因子0.4~0.7份。3.如权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述抗毒物质包括还原型谷胱甘肽。4.如权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述生长因子包括红糖。5.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物为粉剂或液体制剂。6.如权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述铁载体采用微杆菌BAB7发酵制备；所述微杆菌BAB7已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbac...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏悦，秦彦军，陈璨，杨宇斯，李栩琪，夏雨，张文武，
申请(专利权)人：杭州秀川科技有限公司，
类型：发明
国别省市：