用于检测样品中的癌症DNA的高灵敏方法技术

本文描述了一种用于检测在来自患者的DNA测试样品中的癌症DNA的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括：(a)对测试样品的多个等分试样进行测序以对每个等分试样产生对应于两个或更多个靶标区域的序列读段，每个所述靶标区域具有在患者的癌症中存在的序列变异；(b)对于每个等分试样，对于每个靶标区域：i.确定具有序列变异的序列读段的数量；ii.确定序列读段的总数；和iii.将i.和ii.与针对该序列变异的一个或多个错误概率分布模型进行比较，其中所述一个或多个模型从不包含该序列变异的DNA获得；和(c)整合步骤(b)的集合性结果，以确定测试样品中是否存在癌症DNA。定测试样品中是否存在癌症DNA。定测试样品中是否存在癌症DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中的癌症DNA的高灵敏方法
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求于2020年8月5日提交的美国临时申请序列号63/061568的权益，该申请通过引用并入本文。

技术介绍

[0003]在许多情况下，癌症治疗可能需要至少两个步骤：第一步治疗意图去除肿瘤细胞，然后是第二步治疗，如果最初的治疗没有完全成功，则旨在根除患者体内任何残留的癌症细胞。用于根除剩余癌症细胞的治疗方法通常与第一种治疗不同。
[0004]最初治疗后，当患者可能明显处于缓解期时，患者体内残留的少量癌症细胞通常被称为“最小残留疾病”(MRD)或残留疾病。这些残留细胞最终将是许多癌症复发的原因。关键是确定患者在初次治疗后疾病复发和再发的可能性，以便最有可能需要额外治疗的患者可以接受额外治疗，而不需要额外治疗者则可以幸免，从而减少对患者的伤害并降低治疗成本。因此，非常需要用于检测最小残留疾病的有效方法。同样关键的是，要有比当前方法(例如，通常通过成像或临床分析进行)更早地检测癌症复发风险的灵敏方法。
[0005]MRD已经在一些血液系统恶性肿瘤中成功检测到，因为可以分析相对大量的DNA，并且可以以直接方式测量常见的肿瘤特异性融合的频率。现在有强有力的证据表明，通过针对循环肿瘤DNA(ctDNA)评估无细胞DNA(cfDNA)，可以检测许多实体肿瘤的MRD。然而，在cfDNA中检测最小残留疾病的问题是，用于检测样品中序列变异的许多测试不够灵敏。现在的许多分子测试都是通过对一组已知基因的cfDNA进行测序来完成的。通过对cfDNA进行测序来检测最小残留疾病的问题是，无细胞DNA中肿瘤DNA的量通常远低于此类方法的检测限。具体而言，预期在具有最小残留疾病的患者的cfDNA中发生单个肿瘤序列变异的频率通常远低于由PCR错误、碱基错误调用和/或DNA损伤产生测序伪影的频率。该问题被以下事实所复杂化：在某些情况下，突变DNA的水平可能如此之低，以至于在所分析的cfDNA样品中，平均而言，每一个被评估的突变的拷贝都不到一个。此外，来源于血液中溶解的白细胞的相对少量的突变DNA可能会导致错误的结果。因此，通过基于测序的方法检测最小残留疾病仍然具有挑战性。
[0006]本公开提供了一种用于检测肿瘤DNA的高度灵敏的方法。该方法可用于诊断最小残留疾病等。
[0007]专利技术概述
[0008]下文描述了一种用于检测来自患者的DNA测试样品中的癌症DNA的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括：(a)对测试样品的多个等分试样进行测序，以对每个等分试样产生对应于两个或更多个靶标区域的序列读段，每个所述靶标区域具有存在于患者的癌症中的序列变异；(b)对于每个等分试样，对于每个靶标区域：i.确定具有该序列变异的序列读段的数量；ii.确定序列读段的总数；和iii.将i.和ii.与对于序列变异的一个或多个错误概率分布模型进行比较，其中所述一个或多个模型从不包含该序列变异的DNA获得；以及(c)整合步骤(b)的集合性结果，以确定测试样品中是否存在癌症DNA。在任何实施方案
中，步骤(b)可以包括iv.消除在统计上不太可能的等分试样数量中高于阈值的变体。这些变体(即在统计上不太可能的等分试样数量中的变体)可以通过以下进行鉴定：测量添加到每个等分试样中的测试样品DNA的量，计算测试样品中癌症DNA的分数和基于i和ii估计观察到具有高于阈值的变体的等分试样数量的概率。
[0009]本专利技术的方法依赖于两个特征：(i)基于等分试样的测序(即，对同一样品的多个等分试样(即已经分割或划分的样品)中的相同靶标区域进行测序)和(ii)分析多个变体，评估在任何等分试样中的信号(与鉴定一个等分试样中的变体DNA然后因为在另一个等分试样中也可以发现相同的变体确定样品确实含有癌症DNA相反)，和在去除统计上不太可能的数据点之后，分析所有数据。
[0010]该方法所解决的一个问题是对于一些样品(即，含有小癌症DNA分数例如少于0.01％的tDNA的样品)，含有特定序列变异的序列读段的数量与噪声引起的变异(即，碱基错误调用、PCR错误、损伤的DNA等的组合)几乎不可区分。因此，在许多情况下，通过传统的测序方法不可能可靠地确定样品中是否含有癌症DNA。
[0011]如上所述，本专利技术是基于等分试样的。例如，在一些实施方案中，该方法可涉及对测试样品的至少3个等分试样中的至少10个靶标区域进行测序，并且在实践中，该方法可涉及对测试样品的至少4个等分试样中的至少24个靶标区域进行测序。尽管基于等分试样的序列最初看起来似乎是一种浪费，因为仍在对相同数量的野生型和变体分子进行测序(但分为多个等分试样)，但基于等分试样的方法的信噪比实际上会增加。具体而言，在样品中有非常少的变体分子(例如，一个或两个变体分子)的情况下，在含有变体分子的等分试样中变体分子与野生型分子的比率将高得多。这进而消除了错误调用，使数据更加可靠。除了增加信噪比之外，该方法比传统方法产生更多的数据，这进而允许通过更完善的统计和/或基于阈值的方法分析数据。例如：(i)所谓的“噪声基底”(即，频繁被错误调用的具有高内在背景的位置)，可以被识别和消除，因为在大多数或所有等分试样中该信号将持续较高(相对于背景)，以及(ii)与高得罕见的信号相关的变体(例如，在一个等分试样中具有对于单个变体分子预期的三倍的序列读段数量的变体，而在其他等分试样中为序列读段数量的背景数量，或者当其他变体仅在一个或零个等分试样中时，在四个等分试样的三个中出现的变体)可以被识别和消除。下面描述各种其他优点。
[0012]根据方法如何实施，该方法可比传统方法具有某些优势。例如，即使样品中癌症DNA的分数小于0.01％，该方法也可用于一致地并可靠地确定DNA样品是否具有癌症DNA。这远低于传统方法的灵敏度水平，也远低于可由错误产生的测序假象的频率。通过评估几个序列变异，该方法还能够检测到其中每个序列变异平均少于单个拷贝的DNA样品中的癌症DNA。
[0013]该方法可以以不牺牲特异性(即产生许多假阳性结果)的情况下达到灵敏度水平的方式实施。ctDNA的存在可以以添加到每个等分试样中的变体分子的水平来估计，而不是DNA测序后的变体读段。这可以减少某些情况下的假阳性(例如，具有高测序深度的DNA分子的低初始输入)，并提供对癌症DNA的全局分数的更准确估计。
[0014]此外，在一些实施方案中，本方法任选地通过在概率连续体中对所有等分试样中的所有变异进行评分(即观察到的分子数量的概率分布)，而不是计算阳性的数量(具有明确ctDNA证据的等分试样的数量)，来确定样品是否包含癌症DNA，以及通过应用简单规则来
确定肯定或否定结果。这允许探索边界信号，这些信号在单独采集时并不显著，但可以结合为跨多个变体的ctDNA的有力证据，从而增加灵敏度。它还允许基于置信度和组合其他数据(例如基于癌症类型或分期的疾病复发的先验概率)的潜力进行灵活报告。
[0015]此外，罕见的错误，如扩增前的DNA损伤或早期循环PCR错误，可以通过该方法直接建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测来自患者的DNA的测试样品中的癌症DNA的方法，其包括：(a)对测试样品的多个等分试样进行测序以对每个等分试样产生对应于两个或更多个靶标区域的序列读段，所述靶标区域各自具有在患者的癌症中存在的序列变异；(b)对于每个等分试样，对于每个靶标区域：i.确定具有序列变异的序列读段的数目；ii.确定序列读段的总数目；和iii.将i.和ii.与对于该序列变异的一个或多个错误概率分布模型进行比较，其中所述一个或多个模型从不包含该序列变异的DNA获得；iv.消除在统计上不太可能的等分试样数量中高于阈值的变体；以及(c)整合步骤(b)的集合性结果，以确定所述测试样品中是否存在癌症DNA。2.权利要求1的方法，其中通过以下鉴定统计上不太可能的等分试样数量：测量添加到每个等分试样中的测试样品DNA的量；使用所有变体或变体子集的测序数据来计算所述测试样品中癌症DNA的分数；和基于i.和ii.，估算观察到高于阈值的包含序列变异的等分试样的数量的概率。3.前述权利要求中任一项的方法，其中DNA的测试样品中癌症DNA的分数等于或小于0.01％。4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)包括对所述测试样品的至少3个等分试样中的至少10个靶标区域进行测序。5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括在步骤(a)之前鉴定所述患者的癌症中存在的序列变异的集合。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述癌症是血液癌症并且所述测试样品包含从来自外周血、淋巴结或骨髓的细胞分离的细胞DNA。7.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：英威达有限公司，
类型：发明
国别省市：